+ Nguyờn tắc:
Dựa trờn sự tương tỏc đặc hiệu giữa KN và KT tương ứng. KT (KT sơ cấp) sau khi liờn kết với KN tạo thành phức hợp KN - KT, tiếp tục được nhận biết bởi KT thứ cấp cú gắn enzyme peroxydase, cuối cựng phức hợp KN - KT sơ cấp - KT thứ cấp được phỏt hiện bằng cỏch cho ủ trong dung dịch cơ chất. Nhờ sự cú mặt của enzyme trờn KT thứ cấp mà cơ chất chuyển từ khụng màu thành sản phẩm cú màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường.
+ Tiến hành:
- Lectin sau khi được tỏch bằng điện di trờn gel SDS-PAGE, được chuyển lờn màng nitrocellulose bằng phương phỏp điện chuyển trong đệm Tris-glycine cú 20% methanol. Trong quỏ trỡnh điện chuyển, vị trớ cỏc băng vẫn được giữ nguyờn.
- Cố định màng bằng dung dịch BSA 1% trong Tris-HCL 10mM, pH 8,0 cú NaCl 150mM (TBS) bằng cỏch lắc nhẹ (30 phỳt - 1 giờ) ở 37oC.Trỏng màng 3 lần bằng đệm TBS để loại bỏ BSA thừa.
- Ủ màng với huyết thanh cú chứa AFP được pha loóng 200 lần. Lắc nhẹ ớt nhất 1 giờ ở 37oC. Trỏng màng 3 lần bằng đệm TBS để loại bỏ protein bỏm khụng đặc hiệu trờn màng.
- Gắn KT khỏng AFP đó cộng hợp với biotin: Ngõm màng trong dung dịch Fab' - biotin từ 30 phỳt- 1 giờ ở nhiệt độ phũng. Rửa màng 3 lần bằng đệm TBS.
- Gắn với ST-PO: Ngõm màng trong dung dịch ST-PO 30 phỳt - 1 giờ ở nhiệt độ phũng. Rửa màng 3 lần bằng đệm TBS.
- Cho cơ chất (OPD + H2O2) : Ngõm màng trong dung dịch cơ chất (OPD + H2O2) pha trong đệm citrate trong tối. Hiện màu, rửa lại bằng nước.