Ứng dụng của lectin

1.3.5.1. Ứng dụng lectin để định loại nhúm mỏu của người

Nhờ đặc tớnh ngưng kết đặc hiệu cao về nhúm mỏu của một số dạng lectin nờn hiện nay chỳng đó được sử dụng như một cụng cụ hữu hiệu để định loại nhúm mỏu theo hệ thống A, B, O, AB. Phương phỏp này thường cho kết quả nhanh, chớnh xỏc mà khụng cần huyết thanh mẫu, tuy nhiờn lectin được sử dụng theo mục đớch này đũi hỏi độ tinh khiết và tớnh đặc hiệu cao.

1.3.5.2. Lectin mớt (Jacalin) và sự tương tỏc với khỏng thể của người

Jacalin là một glycoprotein cú khối lượng phõn tử thay đổi từ 36-65 kDa tuỳ thuộc vào kỹ thuật phõn tớch khỏc nhau. Cỏc nhà khoa học từ trước tới nay vẫn xem jacalin tồn tại dưới dạng kết hợp của hai tiểu đơn vị  và ’ thụng qua liờn kết khụng cộng hoỏ trị.

Năm 1989, Young và cộng sự bằng phương phỏp sắc ký lỏng cao ỏp đó phỏt hiện thấy jacalin cũn một tiểu đơn vị nữa là . Tiểu đơn vị này là một peptide tương đối kị

nước gồm 20-22 amino acid. Lectin mớt tồn tại dưới nhiều dạng khỏc nhau do sự khỏc nhau trong trỡnh tự amino acid của cỏc chuỗi , ’, . Trong những năm 1993-1995, Đỗ Ngọc Liờn và cỏc cộng sự cũng đó chứng minh được sự cú mặt của cỏc chuỗi  và  trong cỏc lectin được tinh sạch từ một số loài mớt Việt Nam [54],[55].

Cấu trỳc bậc 4 dạng tetrame của jacalin được tạo bởi 2 chuỗi , một chuỗi  và một chuỗi ’. Một số tỏc giả cho rằng lectin mớt cú cấu trỳc hexame. Bằng phương phỏp điện di miễn dịch SDS-PAGE, cỏc nhà khoa học đó phỏt hiện chuỗi  cú Mr =15,8 kDa, chuỗi  cú Mr =2,1 kDa [54],[55].

Lectin mớt (jacalin) cú khả năng ngưng kết hồng cầu người, cho phản ứng kết tủa với một số glycoprotein trong đú cú cả IgA người, chỳng liờn kết với cỏc mono và disaccharide. Ái lực của lectin đối với từng loại đ-ờng là khác nhau, th-ờng jacalin có ái lực mạnh hoặc vừa phải với Gal, Gal-NAc và các dẫn xuất  của đ-ờng galactose, còn một số disaccharide mang liên kết  th-ờng có ái lực yếu với jacalin nh- lactose và Lac-NAc.

Tính chất điển hình của lectin là có khả năng liên kết với các gốc đ-ờng tự do và các gốc đ-ờng nằm trên bề mặt tế bào. Sự t-ơng tác này đ-ợc biểu hiện ở sự t-ơng tác với các gốc đ-ờng của globulin miễn dịch nh- kháng thể IgA và IgG.

Năm 1979, Chaterjee đã phát hiện lectin mít có khả năng kết tủa IgA và IgD [72] . Sau này vào năm 1985, Rocque và Campos đã thực hiện thí nghiệm và chứng minh lectin mít có khả năng kết tủa IgA1 mà không kết tủa Ig khác [72] . Về sau các nhà khoa học đã chứng minh đ-ợc rằng lectin mít tạo kết tủa đặc tr-ng với IgA1, không tạo kết tủa với IgA2 và khả năng phản ứng rất yếu với IgD. Nguyên nhân tạo ra khả năng kết tủa lectin với IgA1 mà không tạo kết tủa với IgA2 là do cấu trúc khác nhau của các gốc đ-ờng có mặt ở hai loại IgA1 và IgA2. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Pháp, jacalin sở dĩ có ái lực cao với IgA1 là do phân tử KT này có chứa những vị trí gắn kết đ-ờng đặc hiệu với jacalin: Gal(1-3)-NAc [42],[46],[47][51].

Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser - Pro- Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser- Pro - Ser Gal- NAc Gal 1,3 Gal-NAc Gal-NAc Gal- NAc

Gal 1,3 Gal 1,3 Gal 1,3

Hỡnh 1.6. Cấu trỳc chuỗi đường của IgA2[43]

Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser - Pro- Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro - Ser- Pro - Ser Gal- NAc Gal 1,3 Gal-NAc Gal-NAc Gal- NAc

Gal 1,3 Gal 1,3 Gal 1,3

Hỡnh 1.7. Cấu trỳc chuỗi đường của IgA1[43]

Hàm lượng khỏng thể là một trong những thụng số đỏng quan tõm lưu ý trong một số bệnh cú liờn quan đến sự thay đổi cỏc khỏng thể miễn dịch. Vỡ vậy, việc định lượng khỏng thể từ huyết thanh người là điều cần thiết, cú ý nghĩa thực tiễn. Ứng dụng khả năng liờn kết đặc hiệu của jacalin với IgA1 mà một số nhà khoa học trờn thế giới và ở Việt Nam đó sử dụng jacalin làm khỏng nguyờn gắn bản để định lượng IgA1 bằng kỹ thuật ELISA. Ngoài ra họ cũng sử dụng jacalin để tinh chế IgA1 từ huyết thanh người, ứng dụng trong điều trị một số bệnh thiếu hụt khỏng thể[40].

1.3.5.3. Lectin đậu, sự tương tỏc với khỏng nguyờn AFP và khỏng thể

Đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) thuộc chi Canavalia, tờn thường

gọi là đậu biển, cú nguồn gốc từ Brazil, thường sống ở cỏc vựng nhiệt đới, được du nhập trồng ở một số tỉnh ven biển của nước ta từ lõu. Đậu dao biển thường cú rễ dài là nơi cú chứa cỏc vi khuẩn cộng sinh cố định nitơ. Vỡ vậy đậu dao biển cũng gúp phần vào việc cố định nitơ từ khụng khớ. Hạt đậu dao biển cú hàm lượng protein cao, cung cấp dinh dưỡng cho người và động vật. Đậu dao biển cú một số giống trồng (Cultivars) biến dạng như Canavalia obtusifolia Lamk D.C. và Canavalia

rosea Swartz D.C.

Lectin đậu dao biển (ConM) cũng giống như lectin thuộc cỏc cõy họ Đậu khỏc, cú trỡnh tự amino acid giống đến 90% so với lectin ConA của đậu rựa (Canavalia ensiformis Jacq

D.C.). Đặc biệt lectin ConM cú hai trung tõm hoạt động, ở đú cần sự cú mặt của hai ion Ca2+ và Mn2+ để đảm bảo hoạt tớnh của nú [52],[59],[60].

Lectin đậu dao biển gần đõy đó được sử dụng nhiều trong cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu khoa học trờn thế giới và Việt Nam. Hiện nay ở Việt Nam chỳng tụi đó và đang bắt đầu nghiờn cứu một số tớnh chất của lectin đậu dao biển và ứng dụng của nú trong nhiều lĩnh vực. Đặc biệt là bước đầu điều tra khả năng ứng dụng của lectin để định loại vi khuẩn và chẩn đoỏn vi khuẩn gõy bệnh trong Y học dựa trờn phản ứng tương tỏc giữa lectin với tế bào vi khuẩn.

Đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) hay cũn gọi là đậu kiếm cú nguồn gốc từ Ấn Độ, nhưng từ lõu đó được trồng ở một số tỉnh miền nỳi nước ta và được gọi là đậu mốo đỏ. Đõy là loài đậu cho năng suất cao và là nguồn thức ăn giàu protein cho người và gia sỳc[14].

Lectin đậu gươm (ConG), giống như lectin đậu dao biển (ConM) và lectin từ hạt đậu rựa (ConA) đều là cỏc protein được cấu tạo bởi 4 tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị cú khối lượng phõn tử khoảng 31 kDa. Trung tõm hoạt động của chỳng đều chứa ion Ca2+ và Mn2+[76],[82].

Lectin đậu rựa (ConA) đó được sử dụng để phõn biệt nhanh chúng 2 căn bệnh ung thư buồng trứng và viờm gan ngay ở giai đoạn sớm. Cả 2 bệnh này đều cú biểu hiện AFP trong mỏu ở hàm lượng rất thấp (10ng/ml), song AFP cú tỷ lệ liờn kết đặc hiệu với ConA từ 12-43% trong bệnh ung thư buồng trứng và dưới 10% trong bệnh viờm gan [66].

Theo Taketa cú 8 loại lectin được ứng dụng trong điện di AFP liờn kết lectin để chẩn đoỏn ung thư gan [90],[92]. Tuy nhiờn, cú hai loại lectin: Lens culinaris agglutinin (LCA) [58] và Erythro phytohemagglutinin (E-PHA) được sử dụng nhiều

nhất trong lõm sàng để giỳp chẩn đoỏn, phõn biệt ung thư gan với viờm gan mạn tớnh[73],[79]. Taketa và cộng sự[99] dựng kỹ thuật điện di để nghiờn cứu ỏi lực của AFP với LCA và kết quả phõn tỏch thành 3 dải: AFP cú ỏi lực mạnh với LCA (kớ hiệu (LCA-L3), AFP cú ỏi lực yếu với LCA (kớ hiệu (LCA-L2), và AFP khụng cú ỏi lực với LCA (kớ hiệu LCA-L1). Trong đú phức hệ AFP-L3 gặp nhiều trong ung thư gan nguyờn phỏt; AFP-L2 gặp nhiều trong ung thư noón hoàng, ung thư gan thứ phỏt, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày... cũn tỷ lệ AFP-L1 gặp nhiều trong viờm gan mạn và xơ gan. Với kết quả này tỏc giả cho biết AFP-L3 cú thể giỳp chẩn đoỏn phõn biệt giữa ung thư gan nguyờn phỏt với bệnh viờm gan mạn tớnh.

Hiệp hội Ung thư Nhật Bản đó lấy tỷ lệ AFP-L3>15% và AFP-P4>12% là mốc và là dấu hiệu (marker) chẩn đoỏn ung thư tế bào gan. Trong nghiờn cứu của Taketa và cộng sự[101], lấy tỷ lệ AFP-L3>15% là mốc chẩn đoỏn ung thư tế bào gan cho biết độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chớnh xỏc của AFP-L3 tương ứng là: 76%, 99,9% và 84,6%. Cũng đối với nghiờn cứu của Taketa và cộng sự, lấy tỷ lệ AFP- P3>12% là mốc chẩn đoỏn ung thư tế bào gan thỡ độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chớnh xỏc của AFP-L3 tương ứng là: 76%, 99,9% và 84,6%. Như vậy AFP-L3 và AFP-P4 cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoỏn ung thư gan.

Do AFP-L3 và AFP-P4 là những dấu hiệu độc lập trong chẩn đoỏn ung thư gan, Taketa và cộng sự đó kết hợp cả hai dấu hiệu này để chẩn đoỏn ung thư gan với độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chớnh xỏc tương ứng là: 95%, 99,7% và 96,6%.

Tại Việt Nam, tiến sĩ Vũ Văn Khiờn và cộng sự[13] đó sử dụng KIT chẩn đoỏn ung thư gan của giỏo sư Taketa, cho biết dấu hiệu AFP-L3 của 65 bệnh nhõn ung thư gan cú độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chớnh xỏc tương ứng là: 96,9%; 92% và 96,9%.

Tuy nhiờn, cũng giống như AFP huyết thanh, cỏc dấu hiệu AFP-L3 và AFP-P4 và nồng độ AFP đều cú liờn quan chặt chẽ đến độ biệt hoỏ tế bào và kớch thước khối u. Trong nghiờn cứu của Taketa và cộng sự, với khối u cú kớch thước <2cm thỡ độ nhạy của AFP-L3 tương ứng là 48%. Tớnh ưu việt lớn nhất của cỏc marker AFP-L3 và AFP- P4 là cú khả năng chẩn đoỏn, phõn biệt và phỏt hiện sớm ung thư gan từ những bệnh nhõn gan mạn tớnh cú AFP huyết thanh tăng nhẹ. Nghiờn cứu của Taketa và cộng sự[101], Shiraki và cộng sự[93], Aoyagi [44]... đều thấy rằng AFP-L3 là một marker tốt giỳp chẩn đoỏn phõn biệt giữa ung thư gan với bệnh viờm gan mạn tớnh.

Cỏc tỏc giả cũng thấy rằng tỷ lệ AFP-L3 dương tớnh (AFP-L3>15%) trước khi khối u gan xuất hiện từ 3-18 thỏng rất cú ý nghĩa, vỡ nú định hướng cho điều trị khi khối u gan cũn nhỏ. Như vậy, thụng qua xỏc định tỷ lệ AFP-L3 đó giỳp cho cỏc thầy thuốc lõm sàng phõn biệt được cỏc trường hợp tăng AFP ở bệnh viờm gan mạn tớnh, mà ta vẫn thường gọi là "dương tớnh giả" và chỉ rừ bản chất cấu trỳc, tớnh chất AFP bệnh lý ở cỏc bệnh nhõn này. Từ đú, định hướng cho sàng lọc, theo dừi và phỏt hiện sớm ung thư gan.

Năm 1970 Spiegelberg và cộng sự [95] đó tinh chế IgG từ huyết thanh người

6 4 Man1 3

4GlcNAc1 4GlcNAc Asn

Hỡnh 1.9. Cấu trỳc chuỗi đường của IgG[64]

GlcNAc1

Neu5Ac2 6Galc1 4GlcNAc1 2Man1

Neu5Ac2 6Galc1 4GlcNAc1 2Man1

Fuc1 6

và ụng thấy rằng mỗi phõn tử IgG chứa cỏc gốc đường liờn kết với asparagine của protein IgG, trong đú chủ yếu liờn kết với Asn297, phần cũn lại liờn kết ở vựng biến đổi của chuỗi H và L. Khỏng thể IgG cũng đó được chứng minh là cú khả năng liờn kết với lectin như lectin đậu rựa ConA được tỏch chiết từ hạt đậu rựa (Canavalia

ensiformis Jacq D.C.).