PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.3.1. Xỏc định hoạt độ lectin

Hoạt độ của lectin được xỏc định dựa vào mức độ ngưng kết hồng cầu người theo phương phỏp của Gebauer trờn bản nhựa đỏy nhọn microtiter [16].

Số đơn vị hoạt độ lectin (HAA) được tớnh là giỏ trị nghịch đảo của độ pha loóng lớn nhất mà ở đú lectin vẫn cũn khả năng gõy ngưng kết tế bào hồng cầu.

Hoạt độ lectin được xỏc định theo hai chỉ số:

+ Hoạt độ tổng số (HĐTS): Được tớnh theo cụng thức:

Trong đú: - V: Thể tớch mẫu thớ nghiệm tớnh bằng l

- n: Mức pha loóng lớn nhất vẫn gõy ngưng kết hồng cầu - HĐTS: Hoạt độ tổng số đơn vị là HAA

+ Hoạt độ riờng (HĐR): Số đơn vị hoạt độ lectin cú trong 1mg protein, được

tớnh theo cụng thức:

mg HDTS

HDR 

Trong đú: - HĐTS: Hoạt độ tổng số tớnh theo cụng thức trờn. - mg : Khối lượng protein tớnh bằng mg.

- HĐR: Hoạt độ riờng của lectin, đơn vị HAA/mg protein.

2.3.2. Xỏc định hàm lượng protein.

2.3.2.1. Xỏc định hàm lượng protein bằng phương phỏp Lowry

+ Nguyờn tắc:

Protein tỏc dụng với thuốc thử Folin tạo thành sản phẩm màu xanh. Dựng mỏy so màu quang phổ để xỏc định cường độ màu của dịch phản ứng ở bước súng 660 nm trong cỏc mẫu và so sỏnh với dịch protein chuẩn (ở đõy sử dụng protein tiờu chuẩn albumin huyết thanh bũ (BSA) - hóng Sigma USA). Phương phỏp cú độ nhạy tương

V.2n HĐTS= 50 V.2n HĐTS= 50

đối cao cho phộp xỏc định nồng độ protein tới vài chục g protein, do vậy được sử dụng rộng rói để định lượng nhiều loại protein ở dạng tương đối tinh khiết[26].

+ Cỏch làm:

Hỳt chớnh xỏc vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch nghiờn cứu, thờm vào 2.5ml dung dịch C (49ml dung dịch Na2CO3 2% + NaOH 0,1M và 1ml dung dịch Cu2SO4 0,5%), lắc đều và giữ ở nhiệt độ phũng trong vũng 15 phỳt. Sau đú thờm chớnh xỏc 0,25 ml dung dịch Folin 1N pha loóng 2 lần lắc đều, sau 30 phỳt đem so màu ở bước súng 660 nm.

Song song với mẫu thớ nghiệm trờn, chỳng tụi làm thớ nghiệm đối chứng, trong đú thay dịch protein bằng đệm PBS và làm cỏc bước tương tự.

+ Lập đồ thị chuẩn protein:

Chuẩn bị cỏc dung dịch protein chuẩn (thường là BSA- Albumin huyết thanh bũ tinh khiết). Từ một dịch gốc ban đầu cú nồng độ 1mg/ml pha loóng thành cỏc dung dịch khỏc nhau chứa hàm lượng protein tương ứng là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1mg/ml. Tiến hành làm phản ứng màu với dịch chuẩn theo thứ tự, thành phần và tỉ lệ cỏc húa chất như với dịch nghiờn cứu. Dựng đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein[37].

Từ kết quả mật độ quang phổ của mẫu thớ nghiệm đối chiếu với đồ thị chuẩn tớnh ra hàm lượng protein trong 1ml dịch nghiờn cứu và tớnh ra hàm lượng % protein trong nguyờn liệu.

Từ đú xõy dựng đồ thị chuẩn theo BSA khi đo ở bước súng 280nm hoặc sử dụng hệ số tắt của BSA là 0,67 để tớnh hàm lượng protein trong mẫu.

Hàm lượng protein được tớnh theo cụng thức:

Hàm lượng protein (mg/ml) = OD280nm x độ pha loóng/0,67

2.3.2.2. Xỏc định hàm lượng protein tổng số bằng phương phỏp quang phổ đo ở bước súng 280nm.

+ Nguyờn tắc: Cỏc amino acid thơm như tryptophan, tyrosine, và

phenylalanine trong chuỗi polypeptide cú phổ hấp thu cực đại ở bước súng 280nm. Biết rằng ở bước súng 280nm thỡ 1ml BSA cú nồng độ 1mg/ml cú mật độ quang học là 0,67; 1ml jacalin cú nồng độ 1mg/ml cú mật độ quang học là 1,22; 1ml IgA

cú nồng độ 1mg/ml cú mật độ quang học là 1,32; 1ml IgG cú nồng độ 1mg/ml cú mật độ quang học là 1,36[69].

Dựa vào đú ta cú thể tớnh được hàm lượng protein, jacalin, IgA, IgG trong mẫu thớ nghiệm theo cỏc cụng thức sau:

- Với protein tớnh theo cụng thức: Y= B.a.V/0,67. - Với jacalin tớnh theo cụng thức: Y= B.a.V/1,22. - Với IgA tớnh theo cụng thức: Y= B.a.V/1,32. - Với IgG tớnh theo cụng thức: Y= B.a.V/1,36. Trong đú:

- B: Mật độ quang học của của 1ml dung dịch mẫu đo ở bước súng 280nm.

- V: Thể tớch dung dịch mẫu. - a: Độ pha loóng dung dịch mẫu.

2.3.3. Tinh chế lectin [84]

2.3.3.1. Kỹ thuật sắc kớ trao đổi ion

Nguyờn tắc của phương phỏp này là phõn tỏch dựa trờn sự khỏc biệt về ion. Protein gắn thuận nghịch với cỏc chất trao đổi bằng tương tỏc ion giữa cỏc nhúm mang điện tớch trỏi dấu, sau đú được chiết rỳt riờng biệt, thường là nhờ việc tăng dần lực ion của đệm hoặc bằng cỏch thay đổi pH khiến cỏc nhúm tương tỏc trờn protein bị mất điện tớch.

2.3.3.2. Kỹ thuật sắc kớ ỏi lực

Sắc kớ ỏi lực là một kỹ thuật rất đơn giản để tinh chế cỏc phõn tử cú hoạt tớnh sinh học. Nguyờn tắc của phương phỏp dựa trờn sự tương tỏc đặc hiệu giữa cấu tử khụng tan và một phõn tử tan khiến phõn tử tan tạm thời trở nờn khụng tan và cho phộp tỏch nú khỏi cỏc tạp chất hoà tan.

Lectin mớt được chiết bằng đệm PBS pH 7,4; kết tủa bằng (NH4)2SO4 65% bóo hoà, ly tõm lạnh ở 8000 vũng/phỳt/20 phỳt, dịch chiết thụ được đưa lờn cột CM-Cellulose, rửa cột bằng đệm PB pH 5,6; phản hấp phụ bằng đệm PBS pH 8,0; thẩm tớch bằng đệm PBS.

2.3.3.4. Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển

Lectin từ bột hạt đậu dao biển được chiết trong đệm TBS pH 7,4 cú ion Ca2+ và Mn2+ 3mM, ly tõm 9000 vũng/phỳt thu dịch trong. Đưa mẫu lờn cột sắc ký Sephadex G-75, rửa cột bằng đệm TBS pH 7,4 cú Mn2+ và Ca2+ 3mM cho đến khi OD280nm= 0 thỡ đẩy cột bằng đệm trờn cú hoà tan glucose 0,5M. Điện di SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm và sử dụng chế phẩm cho cỏc hướng nghiờn cứu tiếp theo.

2.3.3.5. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm

Lectin ConG từ bột hạt đậu được chiết bằng đệm PBS pH 7,4; kết tủa bằng (NH4)2SO4 65% bóo hoà, ly tõm lạnh ở 8000 vũng/phỳt/20 phỳt, thẩm tớch bằng đệm PBS, phản hấp phụ bằng glucose 0,2M.

2.3.4. Điều chế cỏc cột sắc kớ ỏi lực

2.3.4.1. Tạo cột sắc kớ ỏi lực Jacalin-Sepharose-4B[69]

Bước 1: Cõn 5g gel Sepharose-4B đó được hoạt hoỏ bằng CNBr, ngõm trong HCl 1mM/15 phỳt. Rửa bằng đệm bicarbonate natri pH 8,3 chứa NaCl 0,5M.

Bước 2: Hoà 50mg jacalin đó được hoà tan trong đệm bicarbonate với gel Sepharose-4B ở bước 1. Lắc nhẹ nhàng hỗn hợp ở 40C/ 8 giờ.

Bước 3: Bao võy nhúm hoạt tớnh cũn lại bằng đệm bicarbonate pH 8,3 chứa glycine 0,2M.

Bước 4: Rửa loại protein khụng gắn vào gel bằng đệm acetate 0,1M chứa NaCl 0,5M pH 4. Rửa đệm bao võy bằng đệm PBS pH 7,4.

Bước 5: Nạp cột. Lưu ý khụng được để tạo bọt, đệm PBS dựng nạp cột cú chứa azit 0,02%.

2.3.4.2. Tạo cột sắc kớ ỏi lực ConM-Sepharose-4B

Phương phỏp này tương tự như mục 2.2.4.1. nhưng ở bước 2 thay 50mg jacalin bằng 50mg ConM.

2.3.5. Tinh chế khỏng thể

2.3.5.1. Xử lớ huyết thanh

Kết tủa huyết thanh bằng (NH4)2SO4 45% bóo hoà. Ly tõm thu kết tủa, hoà tan kết tủa trong PBS pH 7,4, thẩm tớch. Thu được dịch phõn đoạn 45% bóo hoà để nạp lờn cột sắc kớ ỏi lực.

2.3.5.2. Tinh chế IgA1

Bước 1: Nạp dịch phõn đoạn huyết thanh kết tủa bằng 45% bóo hoà (lặp lại 15 lần) lờn cột sắc kớ ỏi lực Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo.

Bước 2: Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4 (để loại bỏ cỏc protein khụng gắn cột) cho tới khi đo OD280nm < 0,02 thỡ dừng lại.

Bước 3: Phản hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6; thu cỏc phõn đoạn đỉnh. Mỗi phõn đoạn được trung hoà bằng đệm Tris -HCL 0,75M pH8,8.

Bước 4: Thu phõn đoạn đỉnh cú OD280nm cao rồi thẩm tớch, thu được chế phẩm IgA1 tinh sạch.

Bước 5: Kiểm tra độ tinh sạch của IgA1 bằng phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide.

2.3.5.3. Tinh chế IgG

Tinh chế IgG bằng cột chuẩn ProteinA-Sepharose-4B (hóng Sigma - USA) và ConM-Sepharose-4B tự tạo.

Cỏc bước được tiến hành tương tự như tinh chế KT IgA1.

2.3.6. Kỹ thuật ELISA [10],[16]

- Đõy là kỹ thuật khỏ nhạy và đơn giản cho phộp xỏc định KN và KT đặc hiệu hoặc KT ở nồng độ thấp.

- Nguyờn tắc của phương phỏp: Sử dụng KN đặc hiệu với KT gắn cộng hợp enzyme cho phộp phỏt hiện KT trong huyết thanh. Khi cú mặt cơ chất, dưới tỏc

dụng của enzyme, cơ chất bị thuỷ phõn cho phản ứng màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ cú phản ứng đặc hiệu KN-KT đó xảy ra. So màu và định lượng được khỏng thể.

2.3.6.1. Kỹ thuật ELISA xỏc định hàm lượng IgA1 trong huyết thanh

Bước 1. Gắn khỏng nguyờn: Nhỏ vào mỗi giếng của bản nhựa đỏy phẳng 50l jacalin tinh sạch cú nồng độ 10g/giếng, bịt kớn, ủ qua đờm ở nhiệt độ phũng. Rửa bản nhựa bằng đệm PBS cú 0,005%Tween, vỗ khụ.

Bước 2. Phủ bản: Nhỏ 250 l đệm blocking vào mỗi giếng, đậy kớn miệng giếng, ủ ở 370C/1giờ, sau đú rửa bản và vỗ khụ.

Bước 3. Gắn khỏng thể: Nhỏ 50l huyết thanh đó được pha loóng 100 lần trong đệm blocking vào mỗi giếng (trừ giếng đối chứng thay bằng đệm blocking), ủ bản ở 370C/2 giờ. Rửa bản 5-7 lần, vỗ khụ.

Bước 4. Gắn cộng hợp: Nhỏ 50l cộng hợp khỏng IgA1 người (anti - IgA1 hó ng LBK) đó được pha loóng 20.000 lần trong đệm blocking, ủ bản ở 370C/1 giờ. Rửa bản, vỗ khụ.

Bước 5. Gắn cơ chất: Nhỏ vào mỗi giếng 50l cơ chất (OPD + H2O2) để trong tối 20 phỳt ở nhiệt độ phũng.

Bước 6. Ngừng phản ứng: Cho vào mỗi giếng 20l H2SO4 4N.

Bước 7: Đọc kết quả ở bước súng 490nm bằng mỏy đọc ELISA 550 (hóng Bio- Rad)

2.3.6.2. Xỏc định điều kiện và thời gian bảo quản của bộ sinh phẩm xột nghiệm IgA1

Để xỏc định điều kiện và thời gian bảo quản của bộ sinh phẩm xột nghiệm IgA1 chỳng tụi tiến hành như sau:

+ Hoạt hoỏ giếng: Bằng 100 l dung dịch glutaraldehyde 0,25% pha trong đệm PBS 0,02M pH 7,4. Ủ ở 370C/ 3 giờ. Rửa 3 lần bằng đệm PBS pH 8,5. Vỗ khụ.

+ Gắn khỏng nguyờn: Nhỏ vào mỗi giếng của bản nhựa đỏy phẳng 50l jacalin tinh sạch cú nồng độ 10g/giếng, bịt kớn, ủ ở 370C/2 giờ.

- Trỏng giếng bằng dung dịch đệm PBS pH 7,4 cú chứa glycerol 15%; 0,02% azit ở 370C/ 2 giờ. Vỗ khụ, bảo quản ở 40C trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau.

+ Sau cỏc khoảng thời gian bảo quản khỏc nhau, bản giếng được lấy ra và rửa

tiếp bằng đệm PBS pH 7,4/ 3 lần nhằm loại bỏ hết glycerol. Rồi tiếp tục từ bước 2 phản ứng ELISA xỏc định hàm lượng IgA1 trong huyết thanh ở mục 2.2.6.1.

2.3.6.3. Kỹ thuật ELISA xỏc định hàm lượng IgG trong huyết thanh

Bước 1. Gắn khỏng nguyờn: Nhỏ vào mỗi giếng của bản nhựa đỏy phẳng 50l ConM tinh sạch cú nồng độ 5g/giếng, bịt kớn, ủ qua đờm ở nhiệt độ phũng. Rửa bản bằng đệm TBS cú 0,005%Tween 20, vỗ khụ.

Bước 2. Phủ bản: Nhỏ 250 l đệm blocking vào mỗi giếng, đậy kớn miệng giếng, ủ ở 370C/1giờ, sau đú rửa bản và vỗ khụ.

Bước 3. Gắn khỏng thể: Nhỏ 50l huyết thanh đó được pha loóng 200 lần trong đệm blocking vào mỗi giếng (trừ giếng đối chứng thay bằng đệm blocking), ủ bản ở 370C/2 giờ. Rửa bản 5-7 lần, vỗ khụ.

Bước 4. Gắn cộng hợp: Nhỏ 50l cộng hợp khỏng IgG người đó được pha loóng 6.000 lần trong đệm blocking, ủ bản ở 370C/1 giờ. Rửa bản, vỗ khụ.

Bước 5. Gắn cơ chất: Nhỏ vào mỗi giếng 50l cơ chất (OPD + H2O2) để trong tối 20 phỳt ở nhiệt độ phũng.

Bước 6. Ngừng phản ứng: Cho vào mỗi giếng 20l H2SO4 4N.

Bước 7: Đọc kết quả ở bước súng 490nm bằng mỏy đọc ELISA 550 (hóng Bio- Rad)

2.3.6.4. Xỏc định điều kiện và thời gian bảo quản của bộ sinh phẩm xột nghiệm IgG

Để xỏc định điều kiện và thời gian bảo quản của bộ sinh phẩm xột nghiệm IgG chỳng tụi tiến hành như sau:

+ Hoạt hoỏ giếng: Bằng 100 l dung dịch glutaraldehyde 0,25% pha trong đệm TBS 0,02M pH 7,4. Ủ ở 370C/ 3 giờ. Rửa 3 lần bằng đệm TBS pH 8,5. Vỗ khụ.

+ Gắn khỏng nguyờn: Nhỏ vào mỗi giếng của bản nhựa đỏy phẳng 50l ConM tinh sạch cú nồng độ 5g/giếng, bịt kớn, ủ ở 370C/2 giờ.

- Trỏng giếng bằng dung dịch đệm TBS pH 7,4 cú chứa glycerol 15%; 0,02% azit ở 370C/ 2 giờ.

- Vỗ khụ, bảo quản ở 40C trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau.

+ Sau cỏc khoảng thời gian bảo quản khỏc nhau, bản giếng được lấy ra và rửa

tiếp bằng đệm TBS pH 7,4/ 3 lần nhằm loại bỏ hết glycerol. Rồi tiếp tục từ bước 2 phản ứng ELISA xỏc định hàm lượng IgG trong huyết thanh ở mục 2.2.6.3.

2.3.6.5. Kỹ thuật ELISA xỏc định khả năng bắt giữ AFP của lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata jacq D.C.)

+ Quy trỡnh gắn bản:

Bước 1. Hoạt hoỏ bản nhựa: Cho vào mỗi giếng 100 l dung dịch glutaraldehyde 0,25% pha trong đệm TBS 0,1M pH 5,0. Ủ ở nhiệt độ phũng qua đờm. Rửa 2 lần bằng đệm TBS. Vỗ khụ.

Bước 2. Gắn ConG vào giếng: Cho vào mỗi giếng 50l ConG ở nồng độ 5g/giếng, ủ bản ở 370C/3 giờ. Rửa bản bằng đệm TBS 0,1M cú NaCl 0,15M pH 8,0 Vỗ khụ.

Bước 3. Ủ đệm Tris 0,1M pH 8,0: Cho vào mỗi giếng 200l dung dịch đệm Tris 0,1M pH 8,0 Ủ ở 370C/2 giờ. Rửa 2 lần bằng đệm TBS pH 7,4 cú NaN3 0,05% và Tween 20 - 0,05%. Vỗ khụ.

Bước 4. Bao võy để loại trừ liờn kết khụng đặc hiệu: Cho vào mỗi giếng 200 l dung dịch đệm blocking cú CaCl2 và MnCl2 3mM. Ủ bản ở 370C/ 1giờ. Rửa 1 lần bằng dung dịch đệm blocking.

+ Quy trỡnh định lượng:

Bước 1. Gắn khỏng nguyờn:

- Cho vào mỗi giếng (đó gắn ConM) 50l dung dịch AFP chuẩn pha loóng ở cỏc nồng độ khỏc nhau trong dung dịch đệm TBS pH 7,4; CaCl2, MnCl2 3mM.

- Ủ ở 370C/90 phỳt.

- Rửa 2 lần bằng dung dịch Tween 20 - 0,05%; thimerosal 0,01%; vỗ khụ. Bước 2. Gắn Fab'- S- biotin (1lg/ml):

- Cho vào mỗi giếng 50l dung dịch Fab'- S- biotin (1g/ml) - Ủ ở 370C/90 phỳt.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch Tween 20 - 0,05%,thimerosal 0,01%; Vỗ khụ. Bước 3. Ủ với ST-PO (streptavidin - peroxidase 1,5g/ml):

- Cho vào mỗi giếng 50l dung dịch streptavidin - peroxidase 1,5g/ml. - Ủ ở nhiệt độ phũng/ 90 phỳt.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch Tween 20 - 0,05%, thimerosal 0,01%; Vỗ khụ. Bước 4. Ủ với OPD 0,66 mg/ml:

- Cho vào mỗi giếng 50l dung dịch (OPD + H2O2) 0,66mg/ml. - Ủ ở nhiệt độ phũng/15-30 phỳt. Cú đậy màng đen.

Bước 5. Ngừng phản ứng:

- Cho vào mỗi giếng 20l dung dịch H2SO4 1,5N. - Đọc ở bước súng = 490nm- tham chiếu = 620nm

2.3.7. Kỹ thuật thẩm tỏch miễn dịch (Western blotting)[16]

+ Nguyờn tắc:

Dựa trờn sự tương tỏc đặc hiệu giữa KN và KT tương ứng. KT (KT sơ cấp) sau khi liờn kết với KN tạo thành phức hợp KN - KT, tiếp tục được nhận biết bởi KT thứ cấp cú gắn enzyme peroxydase, cuối cựng phức hợp KN - KT sơ cấp - KT thứ cấp được phỏt hiện bằng cỏch cho ủ trong dung dịch cơ chất. Nhờ sự cú mặt của enzyme trờn KT thứ cấp mà cơ chất chuyển từ khụng màu thành sản phẩm cú màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường.

+ Tiến hành:

- Lectin sau khi được tỏch bằng điện di trờn gel SDS-PAGE, được chuyển lờn màng nitrocellulose bằng phương phỏp điện chuyển trong đệm Tris-glycine cú 20% methanol. Trong quỏ trỡnh điện chuyển, vị trớ cỏc băng vẫn được giữ nguyờn.

- Cố định màng bằng dung dịch BSA 1% trong Tris-HCL 10mM, pH 8,0 cú NaCl 150mM (TBS) bằng cỏch lắc nhẹ (30 phỳt - 1 giờ) ở 37oC.Trỏng màng 3 lần bằng đệm TBS để loại bỏ BSA thừa.

- Ủ màng với huyết thanh cú chứa AFP được pha loóng 200 lần. Lắc nhẹ ớt nhất 1 giờ ở 37oC. Trỏng màng 3 lần bằng đệm TBS để loại bỏ protein bỏm khụng