ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima Aublet) và LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.)
3.1.1. Tinh chế lectin jacalin từ ba loài mớt (A. heterophyllus Lamk; A. chempeden Gagn. và A. masticata Gagn.) chempeden Gagn. và A. masticata Gagn.)
3.1.1.1. Quy trỡnh tinh chế lectin jacalin
Lectin mớt đó được tinh chế bởi một số tỏc giả trong và ngoài nước bằng nhiều hỡnh thức khỏc nhau. Tỏc giả Đỗ Ngọc Liờn và một số nhà khoa học Phỏp [20],[54],[55] tỏc giả Trương Văn Chõu (1996) [3] đó tinh chế lectin mớt mật (A.
heterophyllus Lamk) bằng quy trỡnh sử dụng 2 giai đoạn sắc kớ nối tiếp nhau (cột sắc kớ lọc gel Sephadex G-75 và cột sắc kớ trao đổi ion DEAE - Trysacryl), tỏc giả Nguyễn Văn Lợi (2002) [23] đó tinh chế lectin mớt dại (A. masticata Gagn.) bằng cột sắc kớ ỏi lực Mucine-Sepharose-4B.
Mặc dự hỡnh thức tinh chế của cỏc tỏc giả trờn cú khỏc nhau, nhưng kết quả thu được là tương đương nhau: Chế phẩm lectin mớt thu được cú hiệu suất cao, hoàn toàn
tinh sạch, chỉ thể hiện 2 băng cú khối lượng phõn tử sấp xỉ 14kDa và 17kDa khi kiểm tra bằng SDS-PAGE.
Trong quy trỡnh tinh chế 3 loại lectin mớt, chỳng tụi đó sử dụng một quy trỡnh mới: Chỉ cần một cột sắc kớ trao đổi ion CM-cellulose và tiến hành thớ nghiệm trong điều kiện lựa chọn pH tối ưu (rửa cột bằng đệm PB pH 5,6; giải hấp phụ bằng đệm PBS pH 8,0). Chế phẩm cỏc lectin mớt thu được cũng hoàn toàn tinh sạch và cú hiệu suất cao. Quy trỡnh tinh chế lectin được hoàn thiện như sau:
Hạt mớt nghiền khụ
Dịch chiết thụ
Chế phẩm lectin thụ
Chế phẩm lectin jacalin tinh sạch
Kiểm tra độ tinh sạch bằng SDS-PAGE
Sử dụng làm KN gắn bản trong kỹ thuật LECTIN-ELISA để
định lượng IgA1 - Tủa bằng (NH4)2SO4 65% bóo hoà.
- Li tõm 8000 v/p/15 phỳt, thu tủa, hoà tan
tủa bằng đệm PBS pH 5,6. Thẩm tớch - Chiết rỳt bằng đệm PBS 0,02M, pH7,4. - Li tõm 8000 v/p/15 phỳt, lấy dịch nổi - Rửa cột bằng đệm PB pH 5,6 - Giải hấp phụ bằng đệm PBS pH 8,0. - Thu cỏc phõn đoạn đỉnh. Thẩm tớch. Cột CM-cellulose Nạp cột Sử dụng làm KN đặc hiệu để tinh chế IgA1
3.1.1.2. Sắc kớ cột trao đổi ion CM-cellulose để tinh chế lectin mớt 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Phân đoạn O D28 0 nm Mít tố nữ Mít dai Mít dại
Hỡnh 3.2. Cỏc phõn đoạn lectin mớt từ cột sắc kớ CM-cellulose: Thấy rừ cả 3
Jacalin từ cỏc hạt mớt dai (A. heterophyllus Lamk), mớt dại (A. masticata
Gagn.) và mớt tố nữ (A. chempeden Gagn.) được tinh chế bằng cột sắc kớ trao đổi ion CM-cellulose, rửa cột bằng đệm PB pH 5,6, giải hấp phụ bằng đệm PBS pH 8,0, thu cỏc phõn đoạn đỉnh. Với cả 3 loại lectin mớt đỉnh đều thuộc phõn đoạn 10, chứng tỏ rằng lực tương tỏc ion giữa CM- cellulose với cả 3 loại lectin mớt là tương đương nhau.
3.1.1.3. Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm jacalin
Lectin mớt sau khi tinh chế, được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide cú SDS [74].
Chỳ thớch:
Cột 1. Protein chuẩn (hóng LBK): Phosphorylase tim bũ: 97,4kDa; BSA: 66,2kDa; Ovalbumin: 45kDa;
Carboanhydrase: 31 kDa; Tripsin inhibitor: 21kDa và Lysozyme 14,4kDa
Cột 2. jacalin mớt dai sau tinh chế Cột 3. jacalin mớt tố nữ sau tinh chế Cột 4. jacalin mớt dại sau tinhchế
Hỡnh 3.3. Điện di SDS-PAGE đỏnh giỏ độ tinh sạch của 3 loại jacalin tinh chế từ cỏc hạt mớt: Cả 3 loại jacalin đều biểu hiện 2 băng là một tiểu
đơn vị cú khối lượng phõn tử khoảng 14 kDa, một tiểu đơn vị cú khối lượng phõn tử khoảng 17 kDa.
Kết quả điện di cho thấy 3 chế phẩm lectin jacalin là hoàn toàn tinh sạch. Cả 3 loại jacalin đều biểu hiện 2 băng: Một tiểu đơn vị cú khối lượng phõn tử khoảng 14 kDa, cũn tiểu đơn vị kia cú khối lượng phõn tử khoảng 17 kDa - chứng tỏ rằng khối lượng phõn tử của 3 loại jacalin từ hạt mớt dai (Artocarpus
heterophyllus Lamk), hạt mớt tố nữ (Artocarpus chempeden Gagn.) và hạt mớt dại (Artocarpus masticata Gagn.) là tương đương nhau. Điều này cũng phần nào chứng minh giả thiết rằng lectin của cỏc loài thực vật cú quan hệ họ hàng gần gũi thỡ cú khối lượng phõn tử tương tự nhau. Đõy cú thể là dấu hiệu phõn loại sinh vật ở mức độ phõn tử để nghiờn cứu sự tiến hoỏ của chỳng. Kết quả này tương tự như kết quả đó được cụng bố trong cỏc cụng trỡnh trước đõy của tỏc giả Đỗ Ngọc Liờn và cộng sự[20],[54],[55], Trương Văn Chõu [3] và Nguyễn Văn Lợi [23]. Như vậy, tinh chế lectin mớt theo quy trỡnh mới chỉ cần một cột sắc kớ trao đổi ion CM-cellulose và tiến hành thớ nghiệm trong điều kiện lựa chọn pH tối ưu nhất thỡ thu được chế phẩm vừa cú độ tinh sạch, vừa cú hiệu suất cao.
3.1.1.4. Tổng kết quỏ trỡnh tinh chế cỏc loại lectin mớt Bảng 3.1. Tinh chế lectin mớt từ 10g bột hạt mớt Hạt mớt Chỉ số Mớt tố nữ mớt dai mớt dại Dịch lờn cột Chế phẩm tinh sạch Dịch lờn cột Chế phẩm tinh sạch Dịch lờn cột Chế phẩm tinh sạch Protein tổng số (mg) 31,076 6,36 33,75 6,43 32,03 6,34 HĐTS (HAA) 2048 1024 4096 2048 45000 27600 HĐR (HAA/mg) 65,903 161 121,363 318,507 1404 4353 Độ sạch tăng (lần) 1 2,44 1 2,624 1 3,1
Tỷ lệ thu hồi hoạt
độ(%) 100 50 100 50 100 61,3
Chú thích:
- HĐR (Hoạt độ riêng): Tính bằng đơn vị HAA/mg.
- Độ sạch: Là tỉ số giữa hoạt độ riêng của chế phẩm với hoạt độ riêng của dịch chiết thô.
- Tỷ lệ thu hồi hoạt độ: Đ-ợc tính bằng tỉ lệ phần trăm giữa hoạt độ tổng số của mẫu lectin tinh sạch thu đ-ợc so với hoạt độ tổng số của dịch chiết ban đầu. Hiệu suất thu hồi hoạt độ của cả 3 loại lectin mít thu đ-ợc sau tinh chế là khá cao. Với lectin mít dại đạt 61,3%, ở mít dai và mít tố nữ đạt 50%. Mặc dù hiệu suất thu hồi hoạt độ của lectin mít dại cao hơn của mít dai và mít tố nữ, nh-ng vì hạt mít dại không phổ biến, hạt nhỏ, vỏ dày nên để thu đ-ợc 10 g bột khô khó hơn so với hạt mít dai và mít tố nữ. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng hạt mít dai làm đối t-ợng nghiên cứu chủ yếu.
Nh- vậy, việc tinh chế theo quy trình mới chỉ cần một cột sắc kí trao đổi ion CM-cellulose và tiến hành thí nghiệm trong điều kiện lựa chọn pH tối -u nhất thì thu đ-ợc chế phẩm vừa có độ tinh sạch, vừa có hiệu suất cao.