II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
3.3.2 Kết quả giải trình tự gene của virus Care
Sau khi tiến hành kỹ thuật RT- PCR và thu được sản phẩm chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT- PCR bằng Kit để loại bỏ hết các thành phần dư thừa sau phản ứng. Sản phẩm sau khi tinh sạch là DNA của virus sẽđược cloning với từng loại mồi đơn (mồi xuôi và mồi ngược) để nhân nhanh số lượng bản sao theo một chiều của đoạn gene (thực hiện phản ứng PCR sequence). Tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự bằng Kit
được cung cấp của nhà sản xuất, sau đó tiến hành giải trình tự gene. Quá trình giải trình tựđược thực hiện bằng máy trình tự Bekman Coulter CEQ 8000 của Mỹ tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y. Kết quả được biểu thị bằng chương trình Geneetyx.
a. Với đoạn gene Haemagglutinin của virus Care
Kết quả giải trình tự đoạn gene Haemagglutinin của virus Care bằng chương trình Geneetyx được biểu hiện ở hình 23, 24.
47
Hình 23. Giản đồ giải trình tự tựđộng thành phần nucleotide của đoạn gene Haemagglutinin của virus Care
57
Hình 24. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của các chủng virus Care nghiên cứu
Ghi chú: Sai khác về nucleotide của các chủng virus Care được biểu thị bằng ký hiệu dấu (.), biểu thị (*) là giống nhau về nucleotide
58
b. Với đoạn gene Phospho protein của virus Care:
Kết quả giải trình tự đoạn gene Phosphor protein của virus Care bằng chương trình Genetyx được biểu hiện ở hình 25, 26
Hình 25. Giản đồ giải trình tự tựđộng thành phần nucleotide của đoạn gene Phospho protein của virus Care.
60
Hình 26. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene P của các chủng virus Care nghiên cứu
Ghi chú: Sai khác về nucleotide của các chủng virus Care được biểu thị bằng ký hiệu dấu (.), biểu thị (*) là giống nhau về nucleotide
Qua hình 23 và hình 25 cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, mỗi đỉnh màu của giản đồđều xác nhận một loại nucleotide, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng trong đó Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh,
61
Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen. Chuỗi nucleotide thu được sau khi giải trình tự xử lý bằng các phần mềm phân tích trên máy tính. Sau khi phân tích chúng tôi thu được toàn bộđoạn gene H của 10 chủng virus Care lựa chọn trong nghiên cứu có độ dài là 1824bp và đoạn gene P có
độ dài là 390bp. Các đoạn gene này được tham chiếu trên ngân hàng gene để
kiểm tra chắc chắn là đoạn gene của virus Care.
Như vậy, việc tách chiết RNA tổng số, quá trình thực hiện RT-PCR và giải trình tự được thực hiện thành công. Trình tự nucleotide của gene H và gene P của các chủng virus Care nghiên cứu đã được xác định.