II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.17.Phương pháp thực hiện phản ứng trung hòa virus
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng trung hòa là ở chỗ bệnh phẩm chứa virus trộn lẫn với huyết thanh miễn dịch và sau một thời gian nhất định giữ
hỗn hợp trong tủ ấm thì virus bị trung hòa và không có khả năng gây bệnh tích cho tế bào Vero-DST.
Để làm phản ứng trung hòa phải chế huyễn dịch tiêu chuẩn chứa virus, chất huyễn dịch này được đựng trong các ống vô trùng mỗi ống chứa 1 ml và
được bảo quản ở -80C. Tùy theo yêu cầu sử dụng mà lấy các ống đó ra thực hiện phản ứng trung hòa. Huyết thanh miễn dịch dùng trong phản ứng trung hòa phải trong suốt được bảo quản tốt và có thểđông khô được.
Việc chuẩn bị virus và huyết thanh cũng như pha loãng chúng phải thực hiện trong điều kiện thật vô trùng. Việc pha loãng virus thực hiện bằng cách pha loãng chất huyễn dịch ban đầu của virus với nước sinh lý và pha loãng theo các tỉ lệ 1/10, 1/100, 1/1000… và cao hơn nữa. Virus đã pha loãng trộn với huyết thanh miễn dịch và giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, mỗi độ pha loãng gây nhiễm cho 5 giếng tế bào Vero -DST
Hiện tượng trung hòa được xác định theo bệnh tích trên tế bào một lớp cảm thụ. Hoạt tính trung hòa của huyết thanh thí nghiệm được coi là chỉ số
TCID50 theo phương pháp Reed and Muench.
Phản ứng trung hòa tiến hành trên tế bào một lớp
Huyết thanh không pha loãng kết hợp với virus pha loãng bậc 10.
Sau khi trộn huyết thanh và virus cần được giữ trong tủ ấm 370C trong một hoặc 40C qua đêm, để virus tiếp xúc với kháng thể, sau đó dùng huyễn dịch này gây nhiễm cho tế bào Vero-DST một lớp mỗi độ pha loãng gây
24
nhiễm cho 5 giếng tế bào. Chúng tôi cũng tiến hành làm đối chứng âm là huyết thanh thường của chó khỏe mạnh.
Kết quả phản ứng trung hòa biểu diễn bằng chỉ số trung hòa. Chỉ số
trung hòa là tỉ lệ giữa liều lượng virus trong phản ứng đối chiếu gây bệnh tích cho 50% tế bào và liều lượng virus trong phản ứng thí nghiệm cũng gây ra bệnh tích với bấy nhiêu tế bào. Nói cách khác chỉ số trung hòa biểu diễn số liều chí tử tối đa của virus bị trung hòa bởi kháng huyết thanh so với đối chiếu.
Huyết thanh đối chiếu Chỉ số trung hòa=
Huyết thanh thí nghiệm
SN
Viết tắt IN = SS
Trong đó IN: Index Neutralisation SN: Serum Normal SS: Serum special
Nếu chỉ số trung hòa dưới 10 là âm tính Nếu chỉ số trung hòa từ 11 - 49 là nghi ngờ
25
Phần III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN