II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.14.Phương pháp chết ạo kháng thể
- Chúng tôi chế kháng thể đa dòng trên chuột lang, bao gồm các bước: Tinh chế kháng nguyên virus, gây tối miễn dịch cho chuột, tinh chế kháng thể
thu được bằng Kít có sẵn hoặc một số phương pháp thông thường khác, xác
định hiệu giá kháng thể (phương pháp ELISA), thử nghiệm chất lượng của kháng thể sản xuất ra. Chuột thí nghiệm là chuột lang không có kháng thể
kháng virus Care, không có mang virus Care.
Phân lô chuột thí nghiệm: Chia lô để tiến hành tiêm kháng nguyên, gây miễn dịch cho chuột thí nghiệm sau đó theo dõi biểu hiện bệnh lý, cuối cùng là lấy máu chuột thí nghiệm, chắt huyết thanh và thu kháng thể kháng virus Care.
Tất cả chia làm 6 lô chuột lang thí nghiệm (mỗi lô có 2 chuột 4-6 tháng tuổi) được nuôi dưỡng chăm sóc phù hợp và đảm bảo sự đồng đều cho các con chuột ở từng lô thí nghiệm. Khi tiêm kháng nguyên cho chuột tiến hành
đánh dấu để tiện cho việc theo dõi và ghi chép.
Lập bảng theo dõi tình trạng sức khỏe của chuột thí nghiệm về 1 số chỉ
20
(thời gian, thời điểm bắt đầu xuất hiện bệnh tích, viêm, đóng vảy, hình thành sẹo và lành vết tiêm hoàn toàn.
- Phương pháp gây miễn dịch cho chuột thí nghiệm
+ Chuẩn bị kháng nguyên (virus):
Kháng nguyên gây miễn dịch là protein kháng nguyên của virus CDV
đã được tinh chế và định lượng (gồm các chủng virus phân lập được: CDV1P, CDV6H, CDV13R, CDV16H, CDV19P, CDVVX. Kháng nguyên gốc được pha loãng trong dung dịch PBS).
+ Chuẩn bị hỗn hợp kháng nguyên và nhũ dầu: Phối trộn kháng nguyên và nhũ dầu theo tỷ lệ 1/1,5.
Mix hỗn hợp kháng nguyên và nhũ dầu bằng kim hai đầu trong một giờ. Sau đó đem đi tiêm cho chuột thí nghiệm ngay.
+ Chuẩn bị dụng cụ tiêm: Áo blue, găng tay, khẩu trang, kéo cắt lông, bút màu đánh dấu khi tiêm, bông cồn sát trùng trước khi tiêm, khay giá cố định chuột khi tiêm.
+ Xác định vị trí tiêm, đường tiêm và tiêm: Tiêm dưới da vùng lưng, hông của từng chuột thí nghiệm, phân bố tiêm ở 2, 3 vị trí khác nhau với lượng kháng nguyên đã chuẩn bị.
Hai tuần sau tiêm lại lần 2 để tăng cường đáp ứng miễn dịch trên chuột, hai tuần tiếp theo tiêm lại lần 3. Cuối cùng sau khoảng 10 ngày tiếp thì tiến hành gây mê, lấy máu chiết kháng thể và mổ khám chuột thí nghiệm. Tiến hành tinh chế kháng thểđa dòng thu được.