II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
3.3.1 Kết quả phản ứng RT-PCR
Từ các nghiên cứu trước đó, chúng tôi tiến hành chọn ra 10 chủng virus phân lập được từ các cơ quan ở những chó mắc Care và 1 chủng virus vacxin
để tiến hành phản ứng RT-PCR. Trước tiên, chúng tôi tiến hành tách chiết RNA của virus Care theo Kit QIAgene, các bước được thực hiện theo đúng hướng dẫn của Kit. Sản phẩm RNA tổng số của các chủng virus Care nghiên cứu thu được sau khi tách chiết sẽ khuếch đại bằng kỹ thuật RT- PCR với sự
tham gia của enzym sao chép ngược (Reverse Transcrip) và sử dụng cặp mồi tương ứng với từng đoạn gene có khả năng phát hiện ra virus Care thuộc nhóm Châu Á để tạo ra các đoạn DNA hoàn chỉnh (cDNA). Sau khi thực hiện 35 chu kỳ của phản ứng RT-PCR, sản phẩm khuếch đại trong máy PCR sẽ
43
được điện di và chụp ảnh. Với từng đoạn gene khác nhau của virus thì ta sẽ
thu được các kết quả của phản ứng RT-PCR là khác nhau.
a. Với đoạn gene Haemagglutinin của virus Care
Với đoạn gene Haemagglutinin của virus Care, chúng tôi chọn ra 10 chủng virus phân lập được từ các nghiên cứu trước và 1 chủng virus vacxin là: CDV1P, CDV2H, CDV3P, CDV5R, CDV6H, CDV10P, CDV12H, CDV13R, CDV16H, CDV19P và CDVVX. Với đoạn gene này, cặp mồi được sử dụng là CDVff1 (5’-TCGAAATCCTATGTGAGATCACT-3’) và CDV- HS2 (5’-ATGCTGGAG ATGGTTTAATTCAATCG-3’). Kết quả của phản
ứng RT- PCR xác định virus Care được trình bày ở bảng 3.11 và hình 21.
Bảng 3.11. Kết quả phản ứng RT- PCR với gene H
STT Chủng virus Care Nguồn gốc Kết quả RT- PCR 1 CDV1P + 2 CDV2H + 3 CDV3P Cần Thơ + 4 CDV5R + 5 CDV6H Hồ Chí Minh + 6 CDV10P + 7 CDV12H + 8 CDV13R Âu Cơ – Thụy Khuê Hà Nội + 9 CDV16H Thái Bình + 10 CDV19P Havet – Hà Nội + 11 CDVVX + 12 Đối chứng âm - 13 Đối chứng dương +
44
Hình 21. Kết quả phản ứng RT- PCR
[Virus Care được phát hiện bằng phản ứng RT- PCR với độ dài của gene Haemagglutinin là 2100bp, thang chuẩn M 100bp DNA Maker, giếng từ 1-11
từ trái qua phải là mẫu của 10 chủng virus Care phân lập và 1 chủng virus vacxin theo thứ tự từ 1 đến 11, giếng 12 là đối chứng âm, giếng 13 là đối
chứng dương].
Qua hình 1 cho thấy sản phẩm điện di cho vạch DNA tương ứng 2100bp theo đúng thiết kế mồi.
b. Với đoạn gene Phospho protein của virus Care
Với đoạn gene Phosphor protein của virus Care chúng tôi chọn ra 10 chủng virus phân lập được từ các nghiên cứu trước và 1 chủng virus vacxin là: CDV1P, CDV2H, CDV3P, CDV5R, CDV6H, CDV10P, CDV12H, CDV13R, CDV16H, CDV19P và CDVVX để tiến hành nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng cặp mồi Upp1 (5’-ATGTTTATGATCACAGCGCGGT-3’) và Upp2 (5’-ATTGGGTTGCACCACTTGTC-3’) để thực hiện phản ứng RT- PCR với chu trình nhiệt đã trình bày. Kết quả phản ứng được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose 1,2% và được trình bày ở bảng 3.12 và hình 22.
45
Bảng 3.12. Kết quả RT-PCR với gene P
STT Chủng virus Care Nguồn gốc Kết quả RT- PCR
1 CDV1P + 2 CDV2H + 3 CDV3P Cần Thơ + 4 CDV5R + 5 CDV6H Hồ Chí Minh + 6 CDV10P + 7 CDV12H + 8 CDV13R Âu Cơ – Thụy Khuê Hà Nội + 9 CDV16H Thái Bình + 10 CDV19P Havet – Hà Nội + 11 CDVVX + 12 Đối chứng dương + 13 Đối chứng âm - Hình 22. Kết quả phản ứng RT-PCR
[Virus Care được phát hiện bằng phản ứng RT- PCR với độ dài của gene
Phosphor protein là 429bp, thang chuẩn M 100bp; giếng từ 1-11 từ trái qua phải là mẫu của 10 chủng virus Care phân lập và 1 chủng virus vacxin theo thứ tự từ 1 đến 11, giếng 12 là đối chứng dương, giếng 13 là đối chứng âm]
46
Qua bảng 3.12 và hình 22 ta nhận thấy vùng gene P của virus Care đã
được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất, không có sản phẩm “giả” và không bị đứt gãy. Với kết quả như vậy đã chứng minh các cặp mồi được lựa chọn trong nghiên cứu là hoàn toàn đặc hiệu với vùng gene P trong hệ gene của virus Care. Đồng thời, chúng tôi thấy rằng toàn bộ quy trình phản ứng PCR là chính xác từ việc thiết kế mồi, chu trình nhiệt, tiến trình thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn đặc hiệu.
Từ kết quả phản ứng RT-PCR với 2 đoạn gene H và P của virus Care
đã khẳng định 6 mẫu cơ quan từ 6 chó trong thí nghiệm với từng đoạn gene trước đó là mắc Care với các triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh. Phản
ứng RT-PCR cho độ nhạy, độ chính xác cao với việc chẩn đoán chó nghi mắc virus Care với nhiều mẫu bệnh phẩm ở nhiều cơ quan khác nhau.