II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.15.Phương pháp ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
21
Bước 1: Phủ kháng nguyên lên đĩa ELISA. Kháng nguyên được pha loãng theo cơ số 10 trong dung dịch PBS, nồng độ pha loãng tuỳ theo hàm lượng kháng nguyên nhiều hay ít. Phủ 50ul kháng nguyên đã pha loãng lên các giếng của đĩa ELISA, ủở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Bước 2: Loại bỏ phần kháng nguyên không gắn trên đĩa bằng cách đổ
mạnh dung dịch kháng nguyên trong đĩa và vảy khô.
Bước 3: Phủ 50ul BSA 1% lên mỗi giếng đã gắn kháng nguyên, để ở
nhiệt độ phòng 30 phút.
Bước 4: Loại bỏ toàn bộ BSA bằng cách đổ mạnh dung dịch trong đĩa và vảy khô.
Bước 5: Gắn kháng thể, kháng thể được pha loãng ở nhiều nồng độ
khác nhau theo cơ số 10 (10-1,10-2,…10-7). Phủ 50ul kháng thể ở các nồng độ
khác nhau lên các giếng kháng nguyên, ủở 37oC trong 1 giờ đồng hồ.
Bước 6: Loại bỏ kháng thể không gắn trên đĩa bằng cách rửa đĩa bằng dung dịch PBS 3 lần.
Bước 7: Phủ 50ul conjugate (kháng kháng thể hoặc protein A) lên mỗi giếng đểở 37oC trong 1 giờđồng hồ.
Bước 8: Loại bỏ conjugate trên đĩa bằng cách rửa đĩa bằng dung dịch PBS 5 lần.
Bước 9: Phủ 50ul TMB và Peroxidase với tỉ lệ 1:1 lên mỗi giếng ủ
trong 5 phút.
Bước 10: Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1N, mỗi giếng nhỏ
50ul để dừng phản ứng và đọc kết quả trên máy ELISA.