II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.16.Phương pháp tinh chế kháng thể
Sau khi mổ chuột lấy máu thì tiến hành các bước tiếp theo để tinh chế
kháng thể:
- Lấy máu chắt huyết thanh bảo quản ởđiều kiện -20oC. - Pha trước dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa.
22
- Đồng nhất huyết thanh và dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa với thể tích bằng nhau.
- Sau khi đồng nhất đểở 4oC qua đêm.
- Ly tâm hỗn dịch ở 25000 vòng/phút/1h/4oC.
- Sau khi siêu ly tâm đổ bỏ dịch giữ lại cặn ly tâm và để trong tủ lạnh - Xử lý membrane bằng cồn 70o và dung dịch EDTA- PBS sau đó rửa sạch bằng nước cất, tráng bằng nước khử ion.
- Hòa tan cặn ly tâm trong nước khử ion.
- Chuyển hỗn dịch vào membrain đã xử lý, thả vào bình nước khử ion
đặt trên máy khuấy từđặt trong tủ lạnh để qua đêm đổi bình nước khác sau 12 giờ, chuyển sang ngâm trong bình đựng 5 lít dung dịch PBS 1X đã được chuẩn bị trước.
- Lấy mẫu ra khỏi bình ngâm PBS 1X, tháo kẹp và chuyển mẫu vào ống falcon 15ml, tiến hành ly tâm trong điều kiện 8000 vòng/phút/30 phút/4oC, loại bỏ cặn, đổ dịch trong sang ống falcon 50ml và bổ sung một lượng dung dịch Binding Buffer với thể tích bằng lượng thể tích dung dịch kháng thể cần tinh chếđể chuẩn bị tinh chế.
- Chuẩn bị cột gel agarose.
Cho Millipore vào đầu cột lọc, gắn van điều chỉnh và điều chỉnh van bằng PBS. Cho 1ml Protein A agarose vào cột lọc, cho PBS chảy qua đến hết
- Tiến hành tinh chế kháng thể:
Cho một lượng thể tích dung dịch Binding Buffer gấp 5 lần thể tích Gel (Protein A agarose) chảy qua cột lọc cho đến hết. Bổ sung kháng thể cần tinh chế đầy cột gel và điều chỉnh tốc độ chảy ra của hỗn dịch khoảng 30 giây/1 giọt, chuyển cột gel có hỗn hợp mẫu vào trong tủ lạnh ngăn mát, kháng thể được giữ lại bên trên cột gel, ta tiến hành thu kháng thể tinh chế theo các bước sau:
23
Cho lượng thể tích dung dịch Binding Buffer gấp 5 lần thể tích gel vào cột, cho chảy qua đến hết, bỏ dung dịch này. Sau đó cho dung dịch Elution Buffer vào cột gel, dung dịch chảy qua cột gel chính là kháng thể đã tinh chế. Kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng máy quang phổ nhiệt khả kiến và phương pháp ELISA.