II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
3.2.1.Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST
Bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch, chúng tôi đã khẳng định chắc chắn sự
có mặt của virus Care trong 55 chó trên tổng số 100 chó nghi mắc bệnh thu thập được. Từ những kết quả chẩn đoán dương tính với virus Care bằng kỹ
thuật hóa mô miễn dịch đó chúng tôi lựa chọn các mẫu có mức độ dương tính cao với virus (bao gồm: phổi, hạch phổi, ruột là những mẫu bệnh phẩm khi nhuộm hóa miễn dịch cho tín hiệu bắt màu của thuốc nhuộm có mầu điển hình - màu nâu vàng và tập trung nhiều đám bắt màu trên tiêu bản) để tiến hành phân lập virus Care trên môi trường tế bào một lớp Vero-DST. Kết quả
chúng tôi đã phân lập được 55 chủng virus Care của 55 chó mắc bệnh từ các mẫu bệnh phẩm là phổi, hạch phổi và ruột. Kết quả phân lập cho thấy tế bào
được gây nhiễm với các mẫu bệnh phẩm trên đều xuất hiện bệnh tích tế bào (CPE - Cytopathogene effect) điển hình của virus Care (bệnh tích kiểu
33
Syncytium hay thể hợp bào bệnh lý đó là các tế bào co cụm lại, hòa màng, bao quanh các nhân tế bào bị phá hủy) tuy nhiên thời gian xuất hiện bệnh tích của các mẫu khác nhau và các chó khác nhau là không giống nhau. Bệnh tích tế bào xuất hiện từ 24 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm virus. Trên cơ cở
nguồn gốc thu thập của các chó mắc Care (Hà Nội, Thái Bình, Hưng Yên, Cần Thơ, Hồ Chí Minh) cũng như độ tuổi mắc bệnh và khả năng, thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào, chúng tôi sơ bộ lựa chọn được 20 chủng virus Care phân lập được đại diện cho các khu vực thu mẫu khác nhau, lứa tuổi khác nhau, thời gian thu mẫu khác nhau cũng như khả năng, thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào để tiếp tục tiến hành nghiên cứu. Kết quả các chủng virus Care được lựa chọn nghiên cứu được chúng tôi trình bày ở bảng 3.5.
34
Bảng 3.5. Nguồn gốc của các chủng virus Care được lựa chọn cho nghiên cứu
STT Chó mắc Care Lứa tuổi Mẫu phân lập Địa điểm Thời gian xuất
hiện CPE Tên virus
1 1 <3 tháng Phổi Cần Thơ 24 giờ CDV1-P 2 2 3-6 tháng Hạch phổi Cần Thơ 36 giờ CDV2-H 3 3 3-6 tháng Phổi Cần Thơ 36 giờ CDV3-P 4 5 <3 tháng Ruột Hồ Chí Minh 36 giờ CDV5-R 5 6 >12 tháng Hạch Phổi Hồ Chí Minh 24 giờ CDV6-H 6 10 >12 tháng Phổi Thụy Khuê, HN 36 giờ CDV10-P 7 11 <3 tháng Ruột Thụy Khuê, HN 48 giờ CDV11-R 8 12 3-6 tháng Hạch phổi Thụy Khuê, HN 36 giờ CDV12-H 9 13 3-6 tháng Ruột Thụy Khuê,HN 24 giờ CDV13-R 10 15 >12 tháng Phổi Thái Bình 36 giờ CDV15-P 11 16 3-6 tháng Hạch Phổi Thái Bình 24 giờ CDV16-H 12 17 3-6 tháng Ruột Thái Bình 36 giờ CDV17-R 13 18 6-12 tháng Phổi Thái Bình 48 giờ CDV18-P 14 19 3-6 tháng Phổi Hanvet, HN 24 giờ CDV19-P 15 20 3-6 tháng Ruột Hanvet, HN 36 giờ CDV20-R 16 22 6-12 tháng Phổi Hanvet, HN 36 giờ CDV22-P 17 23 6-12 tháng Phổi Hanvet, HN 48 giờ CDV23-P 18 25 <3 tháng Ruột Hưng yên 48 giờ CDV25-R 19 42 3-6 tháng Hạch phổi Hưng Yên 36 giờ CDV42-H 20 53 3-6 tháng Hạch phổi Hưng Yên 48 giờ CDV53-H
35
Các chủng virus được lựa chọn nghiên cứu, sau khi quan sát thấy có bệnh tích tế bào, chúng tôi đã dùng phương pháp hóa miễn dịch tế bào để
khẳng định chắc chắn bệnh tích tế bào là do virus Care gây nên. Qua các mẫu bệnh phẩm đó ta phân lập được chủng virus tương ứng (CDV1-P: là virus
được phân lập từ phổi của chó số 1 mắc bệnh Care). Chúng tôi tiến hành thu virus bảo quản ở -800C để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo và đặt tên các virus phân lập được như bảng 3.5.
3.2.2 Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) và hiệu giá của các chủng virus Care phân lập được
Sau khi phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm và lựa chọn được 20 chủng virus đại diện như bảng 3.5, chúng tôi tiếp tục tìm hiểu sâu thêm về khả
năng nhân lên trên môi trường tế bào của các chủng virus Care phân lập được. Trong nghiên cứu này chúng tôi không chỉ tiến hành nghiên cứu với những virus phân lập được mà còn đồng thời tiến hành đối với cả chủng virus vacxin Onderstepoort để so sánh khả năng nhân lên, hủy hoại tế bào của các chủng Care phân lập được với chủng virus vacxin.
Để đánh giá một cách khách quan khả năng gây bệnh tích tế bào, virus phân lập được xác định hiệu giá để tính toán giá trị TCID50. Sau đó mới đem gây nhiễm lên môi trường tế bào Vero-DST ở cùng một tỷ lệ MOI là 0.01. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của các chủng virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST được thể hiện ở bảng 3.6.
36
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus Care
CPE (%) STT Virus
12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi 1 CDV1-P - * 50 100 B B B B 2 CDV2-H - - * 30 70 100 B B 3 CDV3-P - - * 20 65 100 B B 4 CDV5-R - - * 25 50 100 B B 5 CDV6-H - * 50 100 B B B B 6 CDV10-P - - * 30 60 100 B B 7 CDV11-R - - - * 10 20 20 20 8 CDV12-H - - * 30 70 100 B B 9 CDV13-R - * 50 100 B B B B 10 CDV15-P - - * 10 20 30 30 30 11 CDV16-H - * 50 100 B B B B 12 CDV17-R - - * 15 35 50 80 100 13 CDV18-P - - - * 10 20 30 30 14 CDV19-P - * 50 100 B B B B 15 CDV20-R - - * 15 30 70 90 100 16 CDV22-P - - * 10 30 65 80 100 17 CDV23-P - - - * 10 20 30 30 18 CDV25-R - - - * 10 20 30 30 19 CDV42-H - - * 20 50 70 100 B 20 CDV53-H - - - * 10 20 30 30 21 Ond - * 50 100 B B B B Chú thích:
Ond : Chủng virus vacxin Onderstepoort - : chưa có bệnh tích tế bào (CPE)
* : CPE dưới 5%
10%: số % tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích bề mặt nuôi cấy B: Tế bào bong tróc hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy
37
Nghiên cứu về khả năng nhân lên trên môi trường tế bào (khả năng gây bệnh tích tế bào) của các chủng virus Care nghiên cứu qua bảng 3.6, chúng tôi thấy rằng virus bắt đầu phá hủy tế bào từ 24 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 60 giờ đến 96 giờ, tuy nhiên thời gian phá hủy tế bào sớm hay muộn tùy thuộc vào từng chủng virus, điều này phụ thuộc vào khả năng gây bệnh tích của từng chủng virus khác nhau. Các chủng có
độc lực cao khả năng nhân lên trên tế bào tốt sẽ gây bệnh tích tế bào sớm, ngược lại các chủng virus độc lực thấp, khả năng nhân lên trên tế bào kém sẽ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gây bệnh tích muộn hơn. Bên cạnh đó công tác lấy mẫu được chuẩn bị và tiến hành tốt cũng có ý nghĩa quan trọng trong việc giữ cho virus sống sót và bảo toàn độc lực, ngược lại thu thập và bảo quản mẫu không đúng quy trình sẽ
làm virus giảm độc lực hoặc chết điều này ảnh hưởng trực tiếp tới việc phân lập giữ giống virus.
Phân tích bảng kết quả cho thấy trong tổng số 20 chủng virus được lựa chọn nghiên cứu có chủng virus gây bệnh tích tế bào sớm, điển hình và phá hủy tế bào hoàn toàn rất giống với chủng virus vacxin đó là các chủng CDV1, CDV6, CDV13, CDV16, CDV19 biểu hiện là thời gian xuất hiện bệnh tích sớm 24h và thời gian hủy hoại hoàn toàn tế bào ngắn 48h, diễn biến bệnh tích tế bào phát triển nhanh trong vòng 24h. Trong 20 chủng virus phân lập được lựa chọn nghiên cứu chúng tôi còn nhận thấy có chủng virus phát triển chậm trên môi trường tế bào, bệnh tích tế bào xuất hiện muộn sau 48h thời gian phá hủy hoàn toàn tế bào dài hơn 96 và không thể phá hủy hoàn toàn tế bào sau khi gây nhiễm như CDV11, CDV15, CDV18, CDV23, CDV25, CDV53. Như
vậy trong tổng số 20 chủng virus được lựa chọn nghiên cứu chúng ta đã bước
đầu xác định được một số chủng virus Care có khả năng nhân lên tốt trên môi trường tế bào Vero-DST để tiếp tục nghiên cứu và loại bỏ các chủng nhân lên kém, không ổn định trên môi trường tế bào.
38
MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ BỆNH TÍCH TẾ BÀO DO VIRUS CARE GÂY RA
Hình 17. CPE do CDV-4H gây ra sau 24 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 18. CPE do Onderstepoort (virus vacxin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm(10X)
Hình 19. CPE do CDV-4H gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 20. Tế bào Vero –DST bình thường (10X)
Sau khi nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus Care, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự ổn định về đặc tính nuôi cấy của virus Care (bằng cách nhân lên 3 thế hệ trên môi trường tế bào Vero-DST) và xác định hiệu giá của các chủng virus Care được lựa chọn để có kết quả lựa chọn các chủng virus cho các bước nghiên cứu sau một cách chính xác nhất. Kết quả về sự ổn định trong nuôi cấy và hiệu giá virus được trình bày ở bảng 3.7.
39
Bảng 3.7. Hiệu giá và đặc tính nhân lên của các chủng virus Care phân lập
STT Chủng virus Ổn định vềđặc tính nuôi cấy TCID50/25µl 1 CDV1-P Ổn định 6,67x104 2 CDV2-H Ổn định 3,16x104 3 CDV3-P Ổn định 6,67x103 4 CDV5-R Ổn định 6,67x103 5 CDV6-H Ổn định 6,67x104 6 CDV10-P Ổn định 6,67x104 7 CDV11-R Không ổn định 3,16x103 8 CDV12-H Ổn định 3,16x104 9 CDV13-R Ổn định 6,67x104 10 CDV15-P Không ổn định 3,16x103 11 CDV16-H Ổn định 6,67x104 12 CDV17-R Không ổn định 6,67x102 13 CDV18-P Không ổn định 3,16x103 14 CDV19-P Ổn định 6,67x104 15 CDV20-R Không ổn định 6,67x102 16 CDV22-P Không ổn định 6,67x102 17 CDV23-P Không ổn định 1,44x103 18 CDV25-R Không ổn định 1,44x103 19 CDV42-H Không ổn định 1,44x103 20 CDV53-H Không ổn định 6,67x102
Căn cứ vào khả năng gây bệnh tích tế bào, khả năng nhân lên ổn định (là các chủng virus nhân lên và gây bệnh tích tế bào như nhau qua 3 thế hệ cấy truyền) và hiệu giá virus xác định được chúng tôi đã chọn ra 10 chủng virus Care
để nghiên cứu quy luật nhân lên trên môi trường tế bào DST của các chủng này. Kết quả các chủng virus Care được lựa chọn được trình bày ở bảng 3.8.
40
Bảng 3.8. Các chủng virus Care được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên STT Chủng virus Ổn định vềđặc tính nuôi cấy TCID50/25µl
1 CDV1-P Ổn định 6,67x104 2 CDV2-H Ổn định 3,16x104 3 CDV3-P Ổn định 6,67x103 4 CDV5-R Ổn định 6,67x103 5 CDV6-H Ổn định 6,67x104 6 CDV10-P Ổn định 6,67x104 7 CDV12-H Ổn định 3,16x104 8 CDV13-R Ổn định 6,67x104 9 CDV16-H Ổn định 6,67x104 10 CDV19-P Ổn định 6,67x104
Để có những nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh học của virus chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy luật nhân lên của virus cả bên trong và bên ngoài tế bào sau khi gây nhiễm. Tế bào Vero –DST sau khi được gây nhiễm virus Care sẽđược thu riêng rẽ ở bên trong và bên ngoài tế bào theo các thời điểm khác nhau từ khi virus bắt đầu nhân lên trên tế bào cho đến khi virus phá hủy hoàn toàn tế bào, xác định hiệu giá virus tại các thời điểm thu và đường cong sinh trưởng của virus chính là đường biểu diễn sự nhân lên của virus qua các thời điểm khác nhau trên tế bào Vero- DST. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9, 3.10 và đồ thị 1, 2 và phụ lục 1.
41
Bảng 3.9. Hiệu giá virus của chủng CDV1-P trong và ngoài tế bào qua thời gian
Virus 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi trong tế bào CDV1-P 0.5 3.16 3.83 7.16 5.16 5.83 3.5 2.83 ngoài tế bào CDV1-P 0.83 0.83 1.16 2.5 3.16 2.83 2.5 1.5
Đồ thị 1: Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng CDV1-H
Bảng 3.10. Hiệu giá virus của chủng CDV2-H trong và ngoài tế bào qua thời gian
12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus ở trong tế bào
CDV2-H 0.5 2.83 3.83 5.16 7.5 5.5 3.83 3.16 Virus ở dịch ngoài tế bào
CDV2-H 1.16 0.5 0.83 2.16 3.16 2.83 2.16 1.16
42 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiên cứu về quy luật nhân lên của 2 chủng virus điểm hình là CDV1- P và CDV2-H qua bảng 3.9, 3.10 và đồ thị 1, 2 chúng tôi thấy hiệu giá virus biến đổi theo thời gian nhân lên của virus trên tế bào. Đối với virus trong tế
bào hiệu giá virus thường cao hơn ngoài tế bào ở tất cả các thời điểm và đạt cao nhất ở 48 giờ đến 60 giờ sau khi gây nhiễm điều này cho thấy virus phát triển rất nhanh bên trong tế bào và đạt cao nhất tại thời điểm này, ngược lại hàm lượng virus bên ngoài tế bào thấp hơn rất nhiều so với bên trong tế bào hiệu giá virus bên ngoài tế bào cao nhất cũng chỉ đạt 3.16 thấp hơn rất nhiều so với bên trong tế bào (7.16).
Như vậy sự nhân lên của virus khi nuôi cấy trên môi trường tế bào không phải là một quá trình liên tục, đồng đều. Cả 2 chủng virus phân lập đều thể hiện rằng chúng xâm nhập, nhân lên trong tế bào mạnh hơn ngoài tế bào. Trong đó, những thời điểm phát triển mạnh trong tế bào của hai virus này không giống nhau hoàn toàn trong toàn bộ thời gian sau khi 2 virus được đem gây nhiễm lên tế bào Vero-DST.