1. Phân lập và kiểm tra số lượng a. Phương pháp gạt trên đĩa thạch
Pha lỗng trong nước vơ khuẩn (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, …) rồi cấy một giọt lên mơi trường dinh dưỡng đặc (mơi trường thạch) và gạt đều trên mặt thạch bằng que gạt thuỷ tinh vơ khuẩn. Đặt cá hộp Pêtri vào nơi cĩ nhiệt độ thích hợp rồi đưoi jkhi các khuẩn lạc mọc lên thì đếm số khuânt lạc trong mỗi hộp. Chỉ nên chọn các độ pha lỗng sao cho số khuẩn lạc ở mỗi trường hợp vào khoảng 30 – 300. Tính ra số lượng vi sinh vật trong mẫu, thực ra là một số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) theo cơng thức sau đây
A = M xa x10n x N
A : Số lượng CFU/1 đơn vị mẫu vật (g hay ml)
M : Số khuẩn lạc tring bình ở 3 hộng lồng cùng độ pha lỗng 10n : Múc độ pha lỗng
N : Hệ số tương quan giữa khối lượng tươi và khối lượng khơ của mẫu (khi là vật rắn như đất, thực phẩm, …
Ngọc Hải
Cĩ thể cải tiến phương pháp này bằng cách cấy 1ml dịch pha lỗng vào hộp Pêtri chứa mơi trường chưa kịp đơng (500C), sau đĩ xoay nhẹ hộp để trộn đều. khơng nên dùng lớp thạch quá dày vì khuẩn lạc sẽ khĩ mọc.
Chọn các khuẩn lạc nằm riêng rẽ để cấy vào ống nghiệp thạch nghiêng với mơi trường phù hợp sẽ được chủng thuần khiết. Nếu nghi ngờ chưa được thuần khiết thì dùng phương pháp cấy gạt trên mặt thặt. Đoạn cuối của vết cấy gạt cĩ thể thấy khuẩn lạc mọc tách riêng rẽ. Cấy chuyền ra thạch nghiêng
Với các lồi vi sinh vật ít ỏi trong các nguồn nước, để phân lập và kiểm tra số lượng của từng lồi, người ta thường dùng phương pháp lọc qua qua màng lọc rồi đặt giấy lọc lên đĩa thạch với mơi trường thích hợp (hình 56).
Nếu chỉ để kiểm tra số lượng vi sinh vật, người ta cĩ thể sử dụng phịng đếm hồng cầu. Đến số lượng vi sinh vật trong 25 ơ nhỏ (1mm2), rồi tính số lượng bình quân trong 1 ơ nhỏ (ví dụ là 28). Chiều sau cuat hộp là 0,02 mm. Vì vậy, số lượng vi sinh vật trong 1 cm3 được tính như sau: 28 x 25 x 50 x 1000 = 3,5.107
Với sinh vật kị khí cũng làm tương tụ những sau đĩ phải đưa vào các thiết bị cĩ thể lấy hết khơng khí ra và thay bằng các khí khác (CO2, N2). Với các thiệt bị nhỏ cần đưa vào túi phản ứng khí và giấy chỉ thị màu (chứa xanh mêtilen). Với buồng cấy kị khí, cần điều chỉnh lượng khí trong buồng cấy này.
2. Quan sát khuẩn lạc
Cần quan sát khuẩn lạc theo 3 tiêu chuẩn: hình dạng nhìn từ trên xuống (dạng chấm, dạng trịn, dạng sợi, dạng khơng đều, dạng rễ, dạng con thoi …); hình dạng nhìn nghiêng (phẳng, nổi đều, lồi, hình gối, dạng cĩ núm ở giữa …) và đặc điểm mép khuẩn lạc (trịn trịa, lượn sĩng, phân thuỳ, nham nhở, dạng sợi, dạng cuộn …).
3. Quan sát hình thái
Cần làm tiêu bnả và nhuộn đơn hay nhuộm kép trước khi kiểm tra dưới kính hiển vi quang học. Thường sử dụng các phương pháp nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm tiên mao, nhuộm vỏ nhầy. Khi cần thiết cịn phải sử dụng tới kính hiển vi nền đen, kính hiển vi phản kha, kính hiển vi huỳnh quang và nếu quan sát vi cấu trúc hoặc quan sát virut thì phải dùng tới kính hiển vi điện tử.
