Cấu trúc của các hợp chất phenol quyết định cơ chế hoạt động chống oxy hóa.
Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol như sau: (1) Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxy hóa khử thấp; (2) Tạo phức với các ion Fe2+ và Cu+ và (3) Kìm hãm
Các hợp chất flavonoid (Fl-OH) nhờ thế oxy hóa khử thấp có thể khử các gốc tự do như peroxyl, alkoxyl và hydroxyl bằng cách nhường nguyên tử hydro .
Fl-OH + R → Fl-O + RH (Với R là gốc tự do)
Gốc flavonoid tự do (Fl-O) sau đó lại kết hợp với một gốc tự do khác để tạo thành hợp chất bền (Hình 1.12).
Hình 1.12. Vô hoạt các gốc tự do bởi flavonoid.
Sắt và đồng là những kim loại đảm nhận những vai trò sinh lý nhất định trong cơ thể như tham gia vận chuyển oxy (hemoglobin), cofactor của nhiều enzyme. Tuy nhiên
các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss để tạo nên các gốc tự do. Các flavonoid có khả năng tạo phức với các kim loại này và hạn chế tác dụng xấu của chúng (Hình 1.13)
Fe3+ O2→ Fe2+ + O2
H2O2 + Fe2+(Cu+) → OH + OH- + Fe3+(Cu2+) O2 + H2O2 → OH + OH- + O2
Hình 1.13. Cơ chế tạo phức giữa các flavonoid và các ion kim loại.
Hoạt động của các xanthine oxidase cũng là một nguồn tạo ra các gốc tự do. Khi
sự có mặt của oxy, enzyme này xúc tác sự oxy hóa xanthine thành acid uric, phân tử
oxy nhận điện tử và trở thành ion superoxyde.
Xanthine + 2O2 + H2O Xanthine oxidase Acid uric + 2O2- + 2H+
Các flavonoid có cấu tạo vòng A giống như vòng purin của xanthine được coi như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxidase do đó ngăn ngừa sự tạo ion
superoxyde.
Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phenol phụ thuộc chặt chẽ vào đặc điểm cấutạo của chúng. Các bộ phận đảm nhiệm chức năng chống oxy hóa của phenol được giới thiệu ở Hình 1.14. Đó là: (1) Các nhóm hydroxyl ở dạng ortho của vòng B có
khả năng cho điện tử; (2) Liên kết đôi giữa C2 và C3và nhóm ceton ở C4đảm bảo việc
phân bố lại điện tử cho vòng B; (3) Các nhóm hydroxyl ở C3 và C5 cùng tạo phức với Ceton ở C4đảm bảo khả năng tạo phức vớikim loại.
Hình 1.14. Các vùng cấu trúc đảm bảo khả năng chống oxy hóa của phenol. 1.3 Thu nhận và ứng dụng polyphenol
1.3.1 Bản chất và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết [2, 3]
1.3.1.1 Khái niệm
Chiết xuất (hay trích ly) là quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất lỏng khác.
Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Chiết là phương pháp được thực hiện nhằm mục đíchđiều chế hay phân tích. Sản phẩm thu được của quá trình chiết là
một dung dịch các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết.
1.3.1.2 Bản chất của quá trình chiết[2]
Có 3 quá trình xảy ra đồng thời trong chiết xuất là: (1) Sự hòa tan của chất tan vào dung môi. (2) Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi.
(3) Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.
Khi nguyên liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, lúc đầu dung môi thấm vào
nguyên liệu, sau đó những chất tan trong tế bào nguyên liệu hoà tan vào dung môi, rồi được khuếch tán ra ngoài tế bào. Trong chiết xuất hợp chất thiên nhiên sẽ xảy ra một số (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
quá trình sau: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích, ...
Khái niệm chung:
Quá trình di chuyển vật chất từ pha này sang pha khác khi hai pha tiếp xúc trực
tiếp với nhau gọi là quá trình khuếch tán (hay là quá trình chuyển khối, quá trình truyền chất).
Quá trình tách chất hoà tan trong nguyên liệu bằng dung môi chính là quá trình chiết xuất nguyên liệu. Ởđây nguyên liệu là pha rắn, dung môi là pha lỏng.
Khi hai pha chuyển động tiếp xúc với nhau, do sự cản trở của pha này đối với
pha kia, nghĩa là do ma sát giữa chúng mà trên bề mặt phân chia pha tạo thành lớp
màng. ở trong lớp màng luôn luôn có chế độ chuyển động dòng, còn ở giữa nhân của
dòng thì có thể có chuyển động xoáy. Đặc trưng di chuyển vật chất trong màng và trong nhân của dòng có khác nhau.
Trong lớp màng, quá trình di chuyển vật chất cơ bản là nhờ sự tiếp xúc giữa các
phân tử và sự tác dụng tương hỗ giữa chúng, do đó quá trình di chuyển vật chất qua
màng được gọi là quá trình khuếch tán phân tử.
Trong nhân của dòng, quá trình di chuyển vật chất nhờ vào sự xáo trộn các phần
tử của dòng, vì thế gọi là khuếch tán đối lưu.
Vận tốc khuếch tán trong lớp màng rất chậm so với vận tốc khuếch tán trong
nhân của dòng, do đó mặc dù lớp màng rất mỏng nhưng nó vẫn có giá trị quyết định đối với quá trình khuếch tán. Vận tốc khuếch tán chung phụ thuộc nhiều vào vận tốc
khuếch tán trong màng.
Khuếch tán phân tử
Khuếch tán phân tử xảy ra trong lớp màng hay trong môi trường đứng yên.
Động lực của quá trình khuếch tán là građien nồng độ theo hướng di chuyển, tức là sự
biến đổi nồng độ trên một đơn vị đường đi.
Vận tốc khuếch tán: Là lượng vật chất đi qua một đơn vị bề mặt trong một đơn
vị thời gian. Theo định luật Fick, vận tốc khuếch tán tỷ lệ với građien nồng độ.Phương trình ứng dụng của định luật Fick về lượng vật chất khuếch tán như sau:
Trong đó:
G : lượng vật chất khuếch tán, [kg]
F : bề mặt khuếch tán, vuông góc với hướng khuếch tán, [m2]
τ : thời gian khuếch tán, [h]
C : nồng độ chất tan, [kg/m3]
x : chiều dài quãng đường khuếch tán, [m]
Hệ số khuếch tán phân tử là lượng vật chất đi qua một đơn vị bề mặt, trong một đơn vị thời gian, khi nồng độ vật chất giảm đi một đơn vị trên một đơn vị chiều dài theo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hướng khuếch tán. Hệ số khuếch tán của một chất đặc trưng cho tính chất khuếch tán
của chất đó trong một môi trường nào đấy.
Công thức tính hệ số khuếch tán phân tử theo Einstein:
Trong đó:
R : hằng số khí.
T : nhiệt độ tuyệt đối.
N : hằng số Avogađro. η : độ nhớt của chất lỏng.
r : bán kính của phần tử khuếch tán.
Ứng dụng:
- Trong quá trình chiết xuấtnguyên liệu thực vật, đặc trưng của quá trình khuếch
tán qua màng tế bào chính là khuếch tán phân tử.
- Dựa vào biểu thức của định luật Fick, ta thấy rằng những yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: Độ mịn của nguyên liệu, thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết
xuất, dung môi chiết, khuấy trộn, kích thước của phần tử khuếch tán.
Khuếch tán đối lưu
Trường hợp vật chất khuếch tán trong môi trường chuyển động, ví dụ khuếch tán từ dòng khí vào dòng chất lỏng giọt. Vật chất khuếch tán từ khí vào lỏng không những nhờ vào chuyển động của phân tử mà còn nhờ vào sự chuyển động của các pha.
Khuếch tán trong môi trường như thế gọi là khuếch tán đối lưu.
Trong chiết xuất, quá trình khuếch tán của chất tan trong dung môi được đặc trưng chủ yếu bằng khuếch tán đối lưu.
Khuếch tán trong môi trường chất lỏng chuyển động được mô tả bằng phương
trình vi phân của khuếch tán đối lưu.
Viết dưới dạng rút gọn:
Phương trình khuếch tán đối lưu rất phức tạp. Tuỳ từng trường hợp cụ thể mà
người ta đã giải phương trình để áp dụng cho những trường hợp riêng. b. Quá trình thẩm thấu
Khái niệm: Quá trình thẩm thấu là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua
một màng có tính chất bán thấm, có nghĩa là màng đó chỉ cho dung môi đi qua mà không cho chất tan điqua. Màng đó gọi là màng bán thấm. Do áp lực thẩm thấu của các
phân tử chất tan, dung môi sẽ được thấm từ pha lỏng có nồng độ chất tan thấp hơn sang
pha lỏng có nồng độ cao hơn, cho đến khi áp lực thuỷ tĩnh cân bằng với áp lực thẩm
thấu.
Ứng dụng: Trong tế bào nguyên liệu, chất nguyên sinh có tính chất bán thấm, vì vậy khi nguyên liệu còn tươi, do tác dụng của chất nguyên sinh mà chỉ có dung môi được thấm vào tế bào làm cho nguyên liệu bị trương nở, còn chất tan trong tế bào thì không khuếch tán ra ngoài được. Do đó trong chiết xuất hợp chất thiên nhiên, người ta
phải tìm cách phá huỷ chất nguyên sinh bằng nhiệt hoặc bằng cồn để thực hiện quá
trình chiết xuất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khái niệm: Quá trình thẩm tích là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua
một màng có tính chất thẩm tích, có nghĩa là màng đó không chỉ cho dung môi đi qua
mà còn cho cả chất tan đi qua, nhưng chỉ cho qua những chất có phân tử nhỏ.
Ứng dụng: Màng tế bào nguyên liệu thực vật có tính chất của một màng thẩm
tích, do đó khi chiết xuất nếu màng tế bào còn nguyên vẹn thì chỉ có chất tan là phân tử
nhỏ và ion (phần lớn là hoạt chất) khuếch tán qua được màng tế bào; còn các chất
có phân tử lớn(thường là chất keo, chất tạp, ...) thì không qua được màng tế bào nên không bị chiết vào dịch chiết. Như vậy, có thể coi màng tế bào như một màng lọc có
tính chọn lọc. Đây chính là ưu điểm của màng tế bào đối với quá trình chiết xuất. Do đó
trong quá trình chiết xuất, không nên xay nguyên liệu quá mịn; vì khi đó màng tế bào bị
phá vỡ, tính chọn lọc của màng tế bào không còn, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình tinh chế.
1.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết
Ba quá trình xảy ra trong quá trình chiết: Khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích. Các
yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp
suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột nguyên liệu…) sẽ quyết định chất lượngvà hiệu quả của quá trình chiết xuất.
Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra về mặt thực vật xem có đúng loài,
đôi khi đúng thứ hay chủng mà chúng ta cần hay không. Cần ghi rõ nơi thu hái, thời
gian thu hái. Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề thời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. Nguyên liệu sau đó có thể được làm khô hoặc để tươi mà chiết. Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzyme. Kích thước của bột nguyên liệu cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết.
1.3.1.4 Những vấn đề cơ bản cần giải quyết khi nghiên cứu quá trình chiết a. Lựa chọn dung môi chiết xuất
Dung môi dùng để chiết các hợp chất khỏi hợp chất thiên nhiên rất đa dạng và thay đổi tùy theo bản chất của mỗi loại hợp chất thiên nhiên. Vì vậy cơ sởđể lựa chọn dung môi chiết là tính phân cực của hợp chất chứa trong hợp chất thiên nhiên và của
dung môi.
Dung môi chiết tùy theo từng loại hợp chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosid, các muối của alcaloid, các hợp chất
polyphenol…) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và các steroid tự do…) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các nồng độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, nguyên liệu tươi được thả từ từ trong cồn tươi vừa để diệt enzyme vừa để hòa tan hoạt chất.
b. Dung môi thích hợp cho chiết xuất polyphenol từ lá ổi
Hiệu quả của quá trình chiết xuất phụ thuộc chính vào sự lựa chọn dung môi chiết [26]. Độ phân cực của hợp chất cần chiết là yếu tố quan trọng nhất để chọn dung
môi. Ái lực phân tử giữadung môi và chất tan, sự chuyển khối, dùng cùng dung môi, an
toàn cho môi trường, sức khỏe con người và khả năng tài chính cũng được xem xét để chọn dung môi chiết cho phù hợp [20]. Một số ví dụ về các loại hợp chất có hoạt tính sinh học và dung môi chiết xuất chúng được trình bày trên Bảng 1.1.
Bảng 1.1: Ví dụ về một số thành phần hoạt tính sinh học được chiết bởi các dung môi khác nhau [26].
Nước là dung môi lành tính, rẻ, dễ sử dụng nhất trong các loại dung môi trên. Dung môi thích hợp để chiết polyphenol là nước, ethanol, và methanol. Những vì độc tính của dung môi methanol nên phần lớn các nghiên cứu chiết xuất polyphenol từ lá
Nước Ethanol Methanol Chloroform Dichloromethanol Ether Acetone
Anthocianin Tanins Anthocianin Terpenoids Terpenoids Terpenoids Flavonoids Tanins Polyphenols Terpenoids Flavonoids Alkaloids (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Saponins Flavonol Polyphenols terpenoids Terpenoids Saponins
Alkaloids Flavones Tanins
ổi sử dụng dung môi chiết là ethanol và nước [6, 13, 24, 33, 40, 49]. Suganya
Tachakittirungrod và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng methanol là dung môi chiết đem lại
hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa từ lá ổi. Trong khi đó, Witayapan
Natitanon và cộng sự (2010) cho thấy chiết bằng nước nóng cho hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa từ lá ổi cao nhất. Qian He và Nihorimbere Venant (2004) thì báo cáo rằng dịch chiết lá ổi với dung môi là ethanol cho hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn khi chiết bằng dung môi là nước.
c. Lựa chọn phương pháp chiết thích hợp
Phương pháp chiết dùng cho mỗi nghiên cứu phải tính đến hiệu quả tổng thể của quá trình, cân đối giữa năng suất chiết và chi phí cho quá trình chiết, điều kiện
máy móc thiết bị có thể đáp ứng, các vấn đề về độc tính và môi trường cũng cần được
xem xét.
1.3.2 Phương pháp chiết xuất
1.3.2.1 Phân loại
Có nhiều cách phân loại, dựa vào các yếu tố khác nhau:
Dựa vào nhiệt độ:
Có hai cách chiết: Chiết ở nhiệt độ thường và chiết nóng. Mỗi cách chiết có dung môi và thiết bị riêng. Chiết ở nhiệt độ thường: Có 2 cách là ngâm kiệt và ngâm phân đoạn. Phương pháp ngâm kiệt cho kết quả tốt hơn vì chiết được nhiều hoạt chất và tiết kiệm được dung môi. Chiết nóng thường áp dụng chiết liên tục hoặc hồi
lưu đối với dung môi dễ bay hơi.
Dựa vào chế độ làm việc: Gồm có chiết gián đoạn, bán liên tục và liên tục.
Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp:
Ngược dòng, xuôi dòng và chéo dòng
Dựa vào áp suất làm việc, có các phương pháp: Áp suất thường (áp suất khí quyển), áp suất giảm (áp suất chân không) và áp suất cao (làm việc có áp lực).
Dựa vào những biện pháp kĩ thuật đặc biệt:
pháp siêu âm, phương pháp tạo dòng xoáy, phương pháp mạch nhịp…
1.3.2.2 Một số phương pháp chiết xuất
Khi chiết xuất, quá trình chiết xuất chủ yếu xảy ra ở hai khu vực: Bên trong
nguyên liệu và giữa các lớp dung môi. Trong đó quá trình xảy ra bên trong nguyên liệu có ảnh hưởng quyết định và phụ thuộc vào bản chất nguyên liệu (cấu trúc, tính chất lý
hóa…). Các phương pháp chiết xuất thường chỉ tác động đến yếu tố bên ngoài, nhằm đạt được hiệu quả cao trong thời gian ngắn đối với mỗi loại nguyên liệu. Dưới đây là một số phương pháp chiết thường gặp.
a. Phương pháp chiết xuất giánđoạn
Phương pháp ngâm
Phương pháp ngâm là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ cổ xưa.
Tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi chuẩn bị nguyên liệu, người ta đổ dung môi vào ngập nguyên liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và
rữa nguyên liệu bằng một lượng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất,
có thể tiến hành khuấy trộn bằng cách khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi đổ lại lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi).
Có nhiều cách ngâm: có thể ngâm tĩnh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc ngâm