3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.Các phương tách chiết collagen
1.3.1. Nguyên lý chung
Nguyên lý chung: quá trình tách chiết là quá trình sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan chất cần thu nhận ra khỏi nguyên liệu. Yêu cầu của quá trình này là khả năng năng hòa tan của dung môi đối với chất cần thu phải là cao nhất để đảm bảo hiệu suất thu hồi sản phẩm, mặt khác khả năng hòa hòa tan của dung môi đối với các chất khác phải là bé nhất để đảm bảo độ sạch và chất lượng cho sản phẩm cần thu.
Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết và chất lượng của sản phẩm của quá trình chiết cần lưu bao gồm:
- Loại dung môi: mỗi chất tan chỉ có thể tan tốt nhất trong một dung môi xác định. Đối với các chất có nguồn gốc sinh học thì đòi hỏi phải có một loại dung môi (đơn chất hoặc hỗn hợp chất) có độ phân cực phù hợp. Vì vậy việc chọn dung môi là quan trọng.
- Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu (v/w): tỷ lệ này cần đủ lớn để năng suất và hiệu suất chiết mới đảm bảo. Tỷ lệ quá lớn sẽ dẫn đến lãng phí dung môi và các chi phí sau chiết sẽ tăng rất nhiều; nếu tỷ lệ quá nhỏ sẽ dẫn đến năng suất và hiệu suất chiết thấp. Vì vậy việc xác định tỷ lệ v/w là cần thiết.
- Nhiệt độ chiết: Nhiệt độ chiết càng cao thì năng suất chiết và hiệu suất chiết càng lớn bởi vì nhiệt độ càng cao thì tốc độ quá trình khuếch tán của chất tan ra dung môi càng lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng nhiệt độ chiết phụ thuộc rất nhiều vào bản chất của chất tan, Nhiệt độ phải được lựa chọn sao cho trong suốt quá trình chiết chất lượng của chất tan vẫn được bảo toàn.
- Thời gian chiết: Trong quá trình tách chiết xảy ra hiện tượng khuếch tán các chất tan, mà quá trình này tỷ lệ thuận với thời gian. Do đó để đảm bảo được hiệu suất tách chiết thì thời gian để thực hiện quá trình phải đủ lớn. Tuy nhiên nếu thực hiện quá trình chiết trong thời gian quá dài có thể sự tác động của dung môi tới chất tan và các yếu tố khác ảnh hưởng tới chất lượng của chất tan. Vì vậy cần đây là yếu tố quan trọng cần nghiên cứu.
- Chế độ khuấy đảo: Quá trình tách chiết có sự tác động cơ học sẽ làm tăng năng suất và hiệu suất chiết do làm tăng vận tốc chuyển động của chất tan và làm tăng quá trình vận chuyển chất tan từ nguyên liệu ra ngoài dung môi. Nếu có thể, cần ứng dụng yếu tố này để làm tăng năng suất tách chiết.
Đối với quá trình tách chiết collagen, là một loại protein khó tan, việc chọn dung môi cần lưu ý một số vấn đề sau:
- Độ phân cực phù hợp, đảm bảo khả năng hòa tan của collagen. - Có độc tính thấp để không ảnh hưởng xấu lên sản phẩm.
- Khả năng hòa tan các chất phi collagen thấp để quá trình tinh sạch sau chiết được thuận lợ và không ảnh hưởng xấu đến CLSP.
- Điểm đẳng điện (pI) của collagen tự nhiên trong thủy sản khoảng 6,0 9,0 [24]; sau khi xử lý qua ngâm nước, ngâm acid, kiềm thì pI giảm chỉ còn 6,5 6,8 [5],tại pI thì khả năng hòa tan của collagen sẽ là thấp nhất, vì vậy pH của dung môi chiết phải xa pI của collagen thì khả năng hòa tan sẽ tốt hơn.
1.3.2. Nguyên lý tách chiết collagen bằng acid
Cơ chế tách chiết collagen bằng cách dùng acid chủ yếu dựa vào sự thay đổi độ tích điện của phân tử collagen. Trong môi trường acid, dư ion H+ các nhóm amin tự do trên mạch phân tử collagen bị proton hoá thành những nhóm mang điện tích dương, trong khi các nhóm cacboxyl tự do ở trạng thái không mang điện. Do đó, trong môi trường acid các phân tử collagen mang điện tích dương. Khi đó, các phân tử nước dễ dàng tương tác với các nhóm mang điên dương, làm tăng khả năng hydrat hoá cho collagen, vì vậy collagen dễ dàng hoà tan vào môi trường chiết. Hơn nữa, các sợi collagen mang điện tích dương cùng dấu sẽ đẩy nhau, do đó collagen tự giãn mạch và phân ly ra môi trường chiết. Phương pháp tách chiết collagen bằng acid được sử dụng rộng rãi, collagen thu được bằng phương pháp này được gọi là “collagen hoà tan bởi acid (ASC)”.
Collagen từ tất cả các mô có thể được tách chiết trực tiếp bằng acid hữu cơ (acid acetic, citric, lactic) hoặc acid vô cơ (hydrochloric). Hiệu suất tách chiết collagen phụ thuộc vào loài động vật, mức độ trưởng thành và các yếu tố của quá trình tách chiết. Shierka và Sadowska (2007) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các loại acid khác nhau tới khả năng tách chiết collagen từ da cá tuyết Baltic (Gadus morhua). Hiệu suất chiết collagen bằng các acid ở nồng độ 0,5 M là: acid citric đạt 60%, acid acetic và acid lactic đạt 90% (tính theo hàm lượng hydroxyproline). Trong khi chiết bằng acid HCl 0,15 M thì hiệu suất chỉ đạt 18%. Khi tách chiết bằng acid HCl, các nhóm amin tích điện dương của collagen liên kết với anion Cl-, dẫn tới làm trung hoà bớt điện tích dương của collagen do đó làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm mang điện. Kết quả là cấu trúc của sợi collagen trở nên chặt chẽ hơn, khả năng liên kết với nước giảm. Vì vậy khả năng hoà tan của collagen bị suy giảm [32].
Từ những ưu điểm của phương pháp tách chiết bằng acid và đặc biệt là bằng các acid hữu cơ, cụ thể là acid acetic như: phương pháp chiết đơn giản, hiệu quả tách chiết cao, ngoài ra acid acetic còn là acid hữu cơ phổ biến, giá thành phải chăng. Do vậy, lựa chọn acid acetic làm tác nhân cho quá trình tách chiết collagen từ da cá tra.
1.3.3. Tách chiết bằng enzyme
Quá trình tách chiết bằng acid thường cho hiệu suất chiết collagen không cao. Do đó để có hiệu suất chiết cao hơn, enzyme pepsin thường được sử dụng trong quá trình chiết.
Emzyme pepsin có khả năng phân cắt peptide đặc hiệu ở vị trí telopeptide của collagen, dẫn tới làm tăng hiệu quả chiết. Skierka và Sadowska (2007) đã chỉ ra rằng, dùng pepsin để tách chiết collagen từ da cá tuyết Baltic đã xử lý với acid acetic rút ngắn được thời gian tách chiết xuống còn 24 giờ và hiệu quả tách chiết tăng từ 55% tới 90%. Sau khi tách chiết ASC collagen, đem phần nguyên liệu còn lại không tan trong acid (chứa các phân tử collagen có liên kết ngang) tiếp tục tách chiết bằng enzyme pepsin thu đươc collagen. Collagen có được theo phương pháp này được gọi là “collagen hoà tan bởi pepsin (PSC)” hoặc “atelocollagen”. Quá trình tách chiết collagen bằng enzyme được minh hoạ trên hình 1.9. Sử dụng enzyme là tác nhân hỗ trợ quá trình chiết collagen là một phương pháp tiềm năng vì những lý do sau:
Các protein phi collagen bị thuỷ phân và dễ dàng loại bỏ trong quá trình kết tủa bằng muối và thẩm tích, cải thiện được độ tinh khiết của collagen.
Thuỷ phân các thành phần protein phi collagen và các telopeptide của collagen làm cho collagen dễ dàng hoà tan trong dung dịch acid, kết quả là làm tăng hiệu quả chiết.
Phân cắt các telopepetide ra khỏi collagen giúp làm giảm tính kháng nguyên cho collagen, tính kháng nguyên là nguyên nhân chính gây trở ngại cho các ứng dụng về thực phẩm và dược phẩm.
Drake và cộng sự (1966) đã chứng minh rằng phần lớn các liên kết nội và ngoại phân tử có trong collagen nằm ở vùng telopeptide. Hơn nữa, Miller (1972) đã chỉ ra cơ chế hoạt động của enzyme pepsin đó là chúng thực hiện phân cắt tại vùng không xoắn telopeptide của collagen nên loại bỏ được được liên kết ngang giữa các phân tử, do đó làm tăng tính tan của collagen. Tuy nhiên, tách chiết collagen bằng pepsin sẽ có sự tác động tới tỷ lệ các thành phần của collagen. Thông thường, tỷ lệ các chuỗi β và γ của PSC collagen giảm so với ASC collagen. Nguyên nhân là do pepsin phân cắt vùng telopeptide có chứa các liên kết ngang, vì vậy các chuỗi β và γ biến đổi thành chuỗi α.
Hình 1.9: Quá trình tách chiết collagen bằng enzyme pepsin
1.4. Tình hình nghiên cứu collagen 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về tách chiết collagen từ rất nhiều loại nguyên liệu bằng cả phương pháp hoá học, phương pháp sinh học và kết hợp giữa phương pháp hoá học và sinh học. Đồng thời, đặc tính của các loại collagen tách chiết cũng được xác định rất phong phú không chỉ về cấu trúc, khối lượng phân tử…mà các tính chất hoá sinh học của collagen cũng được nghiên cứu. Sau đây là một số nghiên cứu về collagen trên thế giới:
Takeshi Nagai và Nobutaka Suzuki (1999) đã nghiên cứu “Tách chiết collagen từ phần nguyên liệu còn lại của công nghiệp chế biến cá - da, xương, vây”. Các tác giả đã
(A): Quá trình thuỷ phân mô có chứa collagen,
(B): Sự phân cắt của pepsin tại vùng telopeptide của collagen, (C): Collagen tan trong pepsin
tách chiết collagen từ da, xương và vây của nhiều loài cá khác nhau và xác định được nhiệt độ biến tính như sau: collagen từ da (25 – 26,5oC), collagen từ xương (29,5 – 30oC) và collagen từ vây (28 – 29,1oC) [33].
Masahiro Ogawa và cộng sự (2003) đã nghiên cứu “Xác định các tính chất hoá sinh của collagen tách chiết từ xương và vảy của cá trống đen (Pogonia cromis) cận nhiệt đới và cá sheepshead seabream (Archosargus probatocephalus)”. Các tác giả đã tách chiết hai loại collagen là collagen tan trong acid và collagen tan trong enzyme pepsin. Collagen hoà tan trong enzyme pepsin thu được bằng cách sử dụng acid acetic kết hợp enzyme pepsin để tách chiết collagen còn loại collagen hoà tan trong acid chỉ sử dụng acid acetic để tách chiết. Các tác giả đã xác định được rằng các loại collagen thu được đều là collagen loại I và có nhiệt độ biến tính lớn hơn 34oC [23]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
L.S. Senaratne và các cộng sự (2006) đã nghiên cứu “Tách chiết và xác định các tính chất đặc trưng của collagen từ da cá lưng nâu toadfish (Lagocephalus glover)”. Đầu tiên các tác giả khử protein phi collagen bằng cách ngâm trong NaOH 0,1 N trong 3 ngày, tiếp theo loại chất béo bằng butyl alcohol 10 % trong 24 h. Sau đó da cá được ngâm trong acid acetic 0,5 M trong 3 ngày và tiếp tục được xử lý bằng enzym pepsin trong 48h để tách chiết collagen. Cuối cùng dùng dung dịch NaCl để kết tủa thu hồi collagen. Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất tách chiết là 54,3 % theo khối lượng khô, cấu trúc phân tử của collagen gồm ba chuỗi α1, α2, α3, nhiệt độ biến tính của Collagen là 28oC, thấp hơn 9oC so với Collagen từ da heo [22].
Lin Wang và các cộng sự (2008) đã nghiên cứu “Tách chiết và xác định các tính chất đặc trưng của collagen từ da, vảy và xương của cá biển sâu redfish (Sebastes mentella)”. Các tác giả đã tiến hành khử protein phi collagen trong da bằng NaOH 1M trong 24 h, khử khoáng trong vảy, xương bằng EDTA 0,5 M và khử chất béo trong xương bằng hexan. Các quá trình khử khoáng và loại chất béo thực hiện trong 24 h. Sau đó da cá tiếp tục được chiết collagen bằng acid acetic 0,5 M trong 48 h và kết tủa bằng dung dịch NaCl. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi và nhiệt độ biến tính của Collagen từ da, vảy và xương lần lượt là 47,5 %; 6,8 %; 10,3 % và 16,7oC; 17,7oC; 17,5oC [21].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, nghiên cứu về collagen nói chung và nghiên cứu về collagen có nguồn gốc từ da cá tra chưa được thực hiện nhiều. Hiện nay có một số nghiên cứu liên quan tới collagen như sau:
Võ Quốc Văn và Hà Thanh Toàn (2008), trường Đại học Cần Thơ đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất gelatin từ da cá Tra”. Theo nghiên cứu này, gelatin được sản xuất theo phương pháp hoá học, nồng độ axit thích hợp cho việc thuỷ phân là 0,05 M, nhiệt độ thích hợp cho việc trích ly là 50oC, thời gian thực hiện thuỷ phân là 3 giờ. Gelatin từ da cá Tra có ít nhất 14 loại axit amin, trong đó proline chiếm tỷ lệ cao nhất (13,73 %). Gelatin có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng từ 95-138 kDa [10].
Trần Thị Huyền (2009), thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất collagen từ da cá Tra”. Tác giả đã xác định thành phần hóa học của da cá Tra như sau: ẩm 61,75 %; tro 1,32 % protein 19,62 % và lipit 16,81 %. Theo nghiên cứu, da cá Tra được xử lý thành phần phi collagen bằng NaOH 0,2 M trong thời gian 66 giờ, chiết collagen trong acid acetic 0,37 M trong thời gian 2,5 ngày. Collagen được kết tủa bằng NaCl 2,05 M trong 4 phút. Kết quả cho hiệu suất thu collagen 31,16 % [3]. Năm 2012, tác giả này đã xác định một số tính chất của collagen từ da cá tra như sau: khả năng giữ nước, nhiệt độ biến tính và khối lượng phân tử bao gồm 4 loại protein có khối lượng là 217 kDa, 185 kDa, 156 kDa, và 104 kDa [4].
Trần Thanh Nhãn (2009), trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh đã nghiên cứu “Tối ưu hoá quy trình sản xuất gelatin từ da cá Basa bằng phương pháp dùng enzym”. Tác giả đã thuỷ phân da cá bằng alcalase. Các thông số của quy trình sản xuất như sau: nồng độ enzym (v/v) 0,05 %, thời gian thuỷ phân: 25 phút, nhiệt độ thuỷ phân: 43oC, pH môi trường thuỷ phân:8, nhiệt độ chiết gelatin 60oC [6].
Qua phần tổng quan cho thấy có nhiều thông tin về da cá, collagen, công nghệ sản xuất collagen cũng như các dẫn liệu được nghiên cứu trên đối tượng khác không phải là cá tra. Như vậy cần làm rõ một cách đầy đủ và hệ thống một số vấn đề là:
1. Tính chất của da cá tra Việt Nam.
2. Quy trình tách chiết phù hợp đối với da cá tra nuôi trồng ở Việt Nam. 3. Một số tính chất của collagen chiết từ da cá tra.
Đề tài này hướng đến giải quyết một số tồn tại trên để có thêm dẫn liệu khoa học cho việc ứng dụng da cá tra vào sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng.
1.5. Một số quy trình sản xuất collagen
Quy trình sản xuất collagen từ da cá tra của Trần Thị Huyền [3]
Sử dụng quy trình của tác giả Trần Thị Huyền để tham khảo và kế thừa một số công đoạn chính trong quá trình tách chiết collagen bao gồm: Xử lý cơ học, Khử tạp chất phi collagen, và kết tủa collagen. Ngoài ra, các thông số biên cũng được kế thừa để tìm thông số tối ưu hoá cho một số công đoạn trong quá trình tách chiết collagen từ da cá tra.
Chiết Collagen bằng acid acetic và tủa bằng NaCl
Sấy lạnh (12±20C, 12h) Collagen NaCl 2,05M Thời gian: 4 phút Xử lý- Rửa nước lạnh Da cá Tra Cắt miếng nhỏ NaOH 0,2M
Thời gian: 2,75 ngày
Rửa sạch
Sấy lạnh (12±20C, 12h)
CH3COOH 0,37M Thời gian: 2,5ngày
Xử lý Butyl alcohol (30%, w/v=1/10, 1ngày)
Rửa sạch Xử lý NaOH
Quy trình sản xuất colllagen từ da cá đỏ biển sâu của Wang [21]
Quy trình tách chiết collagen từ da cá đỏ biển sâu của được tham khảo và kế thừa thông số nồng độ NaCl 0,9 M làm thông số cho quá trình kết tủa khi tiến hành nghiên cứu công đoạn chiết collagen. Ngoài ra các thông số của quy trình còn được sử dụng để so sánh, bình luận trong suốt quá trình nghiên cứu.
Kết tủa collagen
Collagen NaCl 0,9 M
Cạo, rửa loại bỏ tạp chất, cắt nhỏ Da cá
NaOH 0,1 M Tỷ lệ 1:20 (w/v) Thời gian 24 giờ
CH3COOH 0,5 M Thời gian: 48 giờ
Rửa sạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Loại bỏ thành phần phi collagen
Chiết collagen
Ly tâm thu dịch chiết
Ly tâm thu tủa
Thẩm tích
Đông khô
Tỷ lệ 1:10 Khuấy đảo
Quy trình tách chiết collagen từ da cá bò một gai lưng của Mehraj [26]
Quy trình tách chiết collagen từ da cá bò một gai lưng được tham khảo để so sánh, đánh giá nhằm xây dựng được quy trình tách các chiết collagen từ da cá tra phù hợp với điều kiện nghiên cứu.
Kết tủa collagen
Collagen Dung dịch NaCl 2,6 M
trong đệm tris 0,05 M
Cạo, rửa loại bỏ tạp chất, cắt nhỏ Da cá NaOH 0,1M Tỷ lệ 1:20 (w/v) CH3COOH 0,5M Tỷ lệ 1:15 (w/v) Rửa sạch
Loại bỏ thành phần phi collacen