3. Ý nghĩa của đề tài
1.4.Tình hình nghiên cứu collagen
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về tách chiết collagen từ rất nhiều loại nguyên liệu bằng cả phương pháp hoá học, phương pháp sinh học và kết hợp giữa phương pháp hoá học và sinh học. Đồng thời, đặc tính của các loại collagen tách chiết cũng được xác định rất phong phú không chỉ về cấu trúc, khối lượng phân tử…mà các tính chất hoá sinh học của collagen cũng được nghiên cứu. Sau đây là một số nghiên cứu về collagen trên thế giới:
Takeshi Nagai và Nobutaka Suzuki (1999) đã nghiên cứu “Tách chiết collagen từ phần nguyên liệu còn lại của công nghiệp chế biến cá - da, xương, vây”. Các tác giả đã
(A): Quá trình thuỷ phân mô có chứa collagen,
(B): Sự phân cắt của pepsin tại vùng telopeptide của collagen, (C): Collagen tan trong pepsin
tách chiết collagen từ da, xương và vây của nhiều loài cá khác nhau và xác định được nhiệt độ biến tính như sau: collagen từ da (25 – 26,5oC), collagen từ xương (29,5 – 30oC) và collagen từ vây (28 – 29,1oC) [33].
Masahiro Ogawa và cộng sự (2003) đã nghiên cứu “Xác định các tính chất hoá sinh của collagen tách chiết từ xương và vảy của cá trống đen (Pogonia cromis) cận nhiệt đới và cá sheepshead seabream (Archosargus probatocephalus)”. Các tác giả đã tách chiết hai loại collagen là collagen tan trong acid và collagen tan trong enzyme pepsin. Collagen hoà tan trong enzyme pepsin thu được bằng cách sử dụng acid acetic kết hợp enzyme pepsin để tách chiết collagen còn loại collagen hoà tan trong acid chỉ sử dụng acid acetic để tách chiết. Các tác giả đã xác định được rằng các loại collagen thu được đều là collagen loại I và có nhiệt độ biến tính lớn hơn 34oC [23].
L.S. Senaratne và các cộng sự (2006) đã nghiên cứu “Tách chiết và xác định các tính chất đặc trưng của collagen từ da cá lưng nâu toadfish (Lagocephalus glover)”. Đầu tiên các tác giả khử protein phi collagen bằng cách ngâm trong NaOH 0,1 N trong 3 ngày, tiếp theo loại chất béo bằng butyl alcohol 10 % trong 24 h. Sau đó da cá được ngâm trong acid acetic 0,5 M trong 3 ngày và tiếp tục được xử lý bằng enzym pepsin trong 48h để tách chiết collagen. Cuối cùng dùng dung dịch NaCl để kết tủa thu hồi collagen. Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất tách chiết là 54,3 % theo khối lượng khô, cấu trúc phân tử của collagen gồm ba chuỗi α1, α2, α3, nhiệt độ biến tính của Collagen là 28oC, thấp hơn 9oC so với Collagen từ da heo [22].
Lin Wang và các cộng sự (2008) đã nghiên cứu “Tách chiết và xác định các tính chất đặc trưng của collagen từ da, vảy và xương của cá biển sâu redfish (Sebastes mentella)”. Các tác giả đã tiến hành khử protein phi collagen trong da bằng NaOH 1M trong 24 h, khử khoáng trong vảy, xương bằng EDTA 0,5 M và khử chất béo trong xương bằng hexan. Các quá trình khử khoáng và loại chất béo thực hiện trong 24 h. Sau đó da cá tiếp tục được chiết collagen bằng acid acetic 0,5 M trong 48 h và kết tủa bằng dung dịch NaCl. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi và nhiệt độ biến tính của Collagen từ da, vảy và xương lần lượt là 47,5 %; 6,8 %; 10,3 % và 16,7oC; 17,7oC; 17,5oC [21].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, nghiên cứu về collagen nói chung và nghiên cứu về collagen có nguồn gốc từ da cá tra chưa được thực hiện nhiều. Hiện nay có một số nghiên cứu liên quan tới collagen như sau:
Võ Quốc Văn và Hà Thanh Toàn (2008), trường Đại học Cần Thơ đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất gelatin từ da cá Tra”. Theo nghiên cứu này, gelatin được sản xuất theo phương pháp hoá học, nồng độ axit thích hợp cho việc thuỷ phân là 0,05 M, nhiệt độ thích hợp cho việc trích ly là 50oC, thời gian thực hiện thuỷ phân là 3 giờ. Gelatin từ da cá Tra có ít nhất 14 loại axit amin, trong đó proline chiếm tỷ lệ cao nhất (13,73 %). Gelatin có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng từ 95-138 kDa [10].
Trần Thị Huyền (2009), thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất collagen từ da cá Tra”. Tác giả đã xác định thành phần hóa học của da cá Tra như sau: ẩm 61,75 %; tro 1,32 % protein 19,62 % và lipit 16,81 %. Theo nghiên cứu, da cá Tra được xử lý thành phần phi collagen bằng NaOH 0,2 M trong thời gian 66 giờ, chiết collagen trong acid acetic 0,37 M trong thời gian 2,5 ngày. Collagen được kết tủa bằng NaCl 2,05 M trong 4 phút. Kết quả cho hiệu suất thu collagen 31,16 % [3]. Năm 2012, tác giả này đã xác định một số tính chất của collagen từ da cá tra như sau: khả năng giữ nước, nhiệt độ biến tính và khối lượng phân tử bao gồm 4 loại protein có khối lượng là 217 kDa, 185 kDa, 156 kDa, và 104 kDa [4].
Trần Thanh Nhãn (2009), trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh đã nghiên cứu “Tối ưu hoá quy trình sản xuất gelatin từ da cá Basa bằng phương pháp dùng enzym”. Tác giả đã thuỷ phân da cá bằng alcalase. Các thông số của quy trình sản xuất như sau: nồng độ enzym (v/v) 0,05 %, thời gian thuỷ phân: 25 phút, nhiệt độ thuỷ phân: 43oC, pH môi trường thuỷ phân:8, nhiệt độ chiết gelatin 60oC [6].
Qua phần tổng quan cho thấy có nhiều thông tin về da cá, collagen, công nghệ sản xuất collagen cũng như các dẫn liệu được nghiên cứu trên đối tượng khác không phải là cá tra. Như vậy cần làm rõ một cách đầy đủ và hệ thống một số vấn đề là:
1. Tính chất của da cá tra Việt Nam.
2. Quy trình tách chiết phù hợp đối với da cá tra nuôi trồng ở Việt Nam. 3. Một số tính chất của collagen chiết từ da cá tra.
Đề tài này hướng đến giải quyết một số tồn tại trên để có thêm dẫn liệu khoa học cho việc ứng dụng da cá tra vào sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng.
1.5. Một số quy trình sản xuất collagen
Quy trình sản xuất collagen từ da cá tra của Trần Thị Huyền [3]
Sử dụng quy trình của tác giả Trần Thị Huyền để tham khảo và kế thừa một số công đoạn chính trong quá trình tách chiết collagen bao gồm: Xử lý cơ học, Khử tạp chất phi collagen, và kết tủa collagen. Ngoài ra, các thông số biên cũng được kế thừa để tìm thông số tối ưu hoá cho một số công đoạn trong quá trình tách chiết collagen từ da cá tra.
Chiết Collagen bằng acid acetic và tủa bằng NaCl
Sấy lạnh (12±20C, 12h) Collagen NaCl 2,05M Thời gian: 4 phút Xử lý- Rửa nước lạnh Da cá Tra Cắt miếng nhỏ NaOH 0,2M
Thời gian: 2,75 ngày
Rửa sạch
Sấy lạnh (12±20C, 12h)
CH3COOH 0,37M Thời gian: 2,5ngày
Xử lý Butyl alcohol (30%, w/v=1/10, 1ngày)
Rửa sạch Xử lý NaOH
Quy trình sản xuất colllagen từ da cá đỏ biển sâu của Wang [21]
Quy trình tách chiết collagen từ da cá đỏ biển sâu của được tham khảo và kế thừa thông số nồng độ NaCl 0,9 M làm thông số cho quá trình kết tủa khi tiến hành nghiên cứu công đoạn chiết collagen. Ngoài ra các thông số của quy trình còn được sử dụng để so sánh, bình luận trong suốt quá trình nghiên cứu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết tủa collagen
Collagen NaCl 0,9 M
Cạo, rửa loại bỏ tạp chất, cắt nhỏ Da cá
NaOH 0,1 M Tỷ lệ 1:20 (w/v) Thời gian 24 giờ
CH3COOH 0,5 M Thời gian: 48 giờ
Rửa sạch
Loại bỏ thành phần phi collagen
Chiết collagen
Ly tâm thu dịch chiết
Ly tâm thu tủa
Thẩm tích
Đông khô
Tỷ lệ 1:10 Khuấy đảo
Quy trình tách chiết collagen từ da cá bò một gai lưng của Mehraj [26]
Quy trình tách chiết collagen từ da cá bò một gai lưng được tham khảo để so sánh, đánh giá nhằm xây dựng được quy trình tách các chiết collagen từ da cá tra phù hợp với điều kiện nghiên cứu.
Kết tủa collagen
Collagen Dung dịch NaCl 2,6 M
trong đệm tris 0,05 M
Cạo, rửa loại bỏ tạp chất, cắt nhỏ Da cá NaOH 0,1M Tỷ lệ 1:20 (w/v) CH3COOH 0,5M Tỷ lệ 1:15 (w/v) Rửa sạch
Loại bỏ thành phần phi collacen
Chiết collagen
Lọc thu dịch chiết
Ly tâm thu tủa
Thẩm tích
Đông khô Loại lipit Butyl alcohol 10% (v/v)
Tỷ lệ 1:10 (w/v) Thời gian 18 giờ
Thời gian 6 giờ Khuấy đảo
Thời gian 48 giờ Khuấy đảo
CHƯƠNG 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Da cá tra 2.1.1. Da cá tra
Da cá tra được cung cấp từ nhà máy đông lạnh Thái Bình Dương, thuộc Công ty Cổ phần Nam Việt, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang được vận chuyển về thành phố Nha Trang bằng xe lạnh -20±2 0C và được bảo quản ở nhiệt độ -20±2 0C, tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafood - F17 cho tới khi sử dụng.
Hình 2.1: Da cá tra của nhà máy Thái Bình Dương, Công ty Cổ phần Nam Việt
2.1.2. Hoá chất
- Kiềm NaOH
- Acid acetic CH3COOH - Muối NaCl
- Acid chlohydric HCl - Hydroxyproline
- p-dimethylaminobenzaldehyde - Muối đồng sunphat CuSO4
- Hidro peroxit H2O2 - Acid sunfuric H2SO4
2.1.3. Máy móc thiết bị
- Máy đo độ nhớt Brookfield DVII+ Pro, hãng sản xuất: Brookfield, Mỹ. - Máy đo quang phổ UV-vis UV mini – 1240, hãng sản xuất: Shimadzu, Nhật Bản. - Máy đo quang phổ UV-vis Cary 100, hãng sản xuất: Varian, Mỹ.
- Tủ sấy chân không OV-01, hãng sản xuất: Jeiotech, Hàn Quốc.
- Máy cô quay chân không Laborota 4001, hãng sản xuất Heidolph, Đức. - Hệ thống đo độ nhớt nội
- Máy lắc ổn nhiệt - Tủ ấm
- Tủ nung - Cân phân tích
- Các dụng cụ thí nghiệm thuỷ tinh
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu các tính chất đặc trưng của da cá tra
Thành phần hoá học bao gồm: ẩm, tro, protein, lipit và collagen.
Một số thông số nhiệt lý bao gồm: khối lượng riêng, điểm băng, nhiệt dung riêng và hệ số dẫn nhiệt.
2.2.2. Nghiên cứu quy trình tách chiết collagen từ da cá tra
Xác định các thông số thích hợp cho quy trình tách chiết bao gồm các công đoạn: - Khử các thành phần phi collagen: protein, lipit, khoáng và sắc tố.
- Chiết collagen - Kết tủa collagen
Sản xuất thử theo quy trình tìm được.
Thu sản phẩm và xác định một số tính chất của sản phẩm.
2.2.3. Xác định một số tính chất của collagen thu được từ quy trình nghiên cứu
1. Nhiệt độ biến tính
2. Bước sóng hấp thụ cực đại 3. Thành phần hoá học cơ bản
4. Thành phần và hàm lượng các acid amin 5. Khả năng bắt gốc tự do DPPH
2.3. Phương pháp nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.1. Phương pháp chung
Dùng phương pháp thực nghiệm, bố trí các thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng và phương pháp cổ điển; phương pháp công nghệ là phương pháp hoá-lý.
2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm:
Sử dụng phần mềm Design Expert 8.0.7.1 (DX 8) và phần mềm Microsoft Office Excel 2003.
2.3.3. Phương pháp phân tích
Sử dụng phương pháp phân tích đang được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu khoa học và đánh giá chất lượng thực phẩm của Việt Nam và thế giới.
1. Phương pháp xác định hàm lượng ẩm: theo TCVN 3700-90.
2. Phương pháp xác định hàm lượng tro toàn phần: theoTCVN 5105-90. 3. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số: theo TCVN 3705-90. 4. Phương pháp xác định hàm lượng lipit: theo phương pháp Folch.
5. Phương pháp xác định hàm lượng collagen trong da cá tra: theo phương pháp của Robert E. Neuman và Milan A. Logan [31] (Phụ lục15).
6. Phương pháp xác định nhiệt độ biến tính của collagen: theo phương pháp của HaiYing [17] và Mingyan [26] (Phụ lục 16).
7. Phương pháp xác định độ nhớt collagen: Độ nhớt của collagen được xác định bằng máy đo độ nhớt Brookfield DVII+ Pro.
8. Phương pháp xác định một số thông số nhiệt lý: thông số nhiệt lý của da cá tra được xác định bằng công thức nghiệm [28] (Phụ lục 17).
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Bố trí quy trình tổng quát tách chiết collagen từ da cá tra
Sơ đồ 2.1: Quy trình nghiên cứu dự kiến
Thuyết minh quy trình: Quy trình tách chiết collagen được xây dựng dựa trên
sự kế thừa của Trần Thị Huyền [3]. Da cá mua về từ nhà máy được rã đông, dùng dao cạo, rửa bằng nước để loại bỏ phần thịt, mỡ, máu cá còn sót lại trên da. Sau đó cắt nhỏ da cá chuẩn bị cho các công đoạn tiếp theo. Da cá đã xử lý cơ học được khử các thành phần tạp chất phi collagen bằng dung dịch NaOH, tiếp theo đem ngâm chiết trong dung dịch acid acetic. Lấy dịch chiết tiến hành kết tủa bằng muối NaCl thu được tủa collagen. Đem tủa đi sấy thu được sản phẩm collagen ở trạng thái khô. Tại các công đoạn Khử tạp chất phi collagen, Chiết collagen và Kết tủa có các thông số đầu vào cần nghiên cứu tương ứng với các công đoạn là nồng độ NaOH, CH3COOH, NaCl và thời gian thực hiện các quá trình. Các quá trình thực hiện ở 5oC được duy trì bằng cách đặt trong tủ lạnh. Da cá tra Xử lý cơ học Khử tạp chất phi collagen Chiết collagen Kết tủa collagen Sấy khô Sản phẩm Nồng độ NaOH? Thời gian xử lý? Tỷ lệ 1:10 (w/v) Nhiệt độ 50C Nồng độ CH3COOH? Thời gian chiết? Tỷ lệ 1:10 (w/v) Nhiệt độ 50C
Nồng độ NaCl? Thời gian tủa?
Rửa
Dịch chiết collagen Da cá không tan
2.4.2. Bố trí lấy mẫu và xử lý mẫu
(A) (B)
Sơ đồ 2.2: Lấy mẫu (A) và xử lý mẫu (B) da cá tra
Thuyết minh sơ đồ: Da cá tra từ nhà máy đông lạnh Thái Bình Dương thuộc Công ty Cổ phần Nam Việt được đông lạnh ở -20 ± 20C, vận chuyển và bảo quản tại phòng thí nghiệm ở nhiệt độ -20 ± 20C. Da cá trước khi tiến hành thí nghiệm được rã đông, tiến hành xử lý cơ học và phân chia thành các mẫu chuẩn bị cho từng thí nghiệm. Da cá sau khi xử lý cơ học tiếp tục được bảo quản đông cho tới khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.3. Bố trí thí nghiệm xác định các tính chất đặc trưng của da cá tra
Sơ đồ 2.3: Xác định các tính chất đặc trưng của da cá tra
Da cá đã xử lý cơ học
Xác định thành phần hoá học
Ẩm Tro Protein Lipit Collagen (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả Thảo luận Xác định thông số nhiệt lý Nhiệt dung riêng Điểm băng Khối lượng riêng Hệ số dẫn nhiệt Kết quả Thảo luận
Đưa vào các thí nghiệm Xử lý cơ học
Bảo quản đông Da cá tra bảo quản đông Da cá tra từ Công ty Nam Việt
(An Giang)
Làm đông
Vận chuyển về phòng thí nghiệm
Thuyết minh sơ đồ: Da cá tra đã xử lý cơ học theo bố trí thí nghiệm 2.4.2 được tiến hành xác định các tính chất bao gồm:
Thông số nhiệt lý gồm có: khối lượng riêng, điểm băng, nhiệt dung riêng, hệ số dẫn nhiệt.
Thành phần hoá học gồm có: ẩm, tro, protein, lipit, collagen.
Kết quả thu được sau các thí nghiệm được xem xét, thảo luận và được xem là cơ sở để nghiên cứu các quá trình xử lý, tách chiết collagen về sau.
2.4.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hoá công đoạn khử tạp chất phi collagen bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
Mục đích của công đoạn khử tạp chất là tìm ra chế độ tách các thành phần phi collagen ra khỏi nguyên liệu hiệu quả nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết collagen sau này. Đồng thời cũng đảm bảo được hàm lượng collagen ban đầu trong da cá ít bị tổn thất nhất.
Trong công đoạn khử tạp chất phi collagen, các yếu tố tỷ lệ da cá/dung dịch là 1/10 (w/v) và nhiệt độ chiết là 5 ± 20C được kế thừa từ nghiên cứu Trần Thị Huyền [3]. Các yếu tố nồng độ NaOH và thời gian xử lý sẽ được nghiên cứu tối ưu hoá bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Các hàm mục tiêu trong công đoạn này bao gồm: hiệu suất khử protein phi collagen (%), hiệu suất khử lipit (%) và mức độ tổn thất collagen (%).
Các yếu tố ảnh hưởng và hàm mục tiêu của công đoạn khử tạp chất phi collagen được mô tả như sau:
Công đoạn khử tạp