3. Ý nghĩa của đề tài
2.1.Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Da cá tra
Da cá tra được cung cấp từ nhà máy đông lạnh Thái Bình Dương, thuộc Công ty Cổ phần Nam Việt, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang được vận chuyển về thành phố Nha Trang bằng xe lạnh -20±2 0C và được bảo quản ở nhiệt độ -20±2 0C, tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafood - F17 cho tới khi sử dụng.
Hình 2.1: Da cá tra của nhà máy Thái Bình Dương, Công ty Cổ phần Nam Việt
2.1.2. Hoá chất
- Kiềm NaOH
- Acid acetic CH3COOH - Muối NaCl
- Acid chlohydric HCl - Hydroxyproline
- p-dimethylaminobenzaldehyde - Muối đồng sunphat CuSO4
- Hidro peroxit H2O2 - Acid sunfuric H2SO4
2.1.3. Máy móc thiết bị
- Máy đo độ nhớt Brookfield DVII+ Pro, hãng sản xuất: Brookfield, Mỹ. - Máy đo quang phổ UV-vis UV mini – 1240, hãng sản xuất: Shimadzu, Nhật Bản. - Máy đo quang phổ UV-vis Cary 100, hãng sản xuất: Varian, Mỹ.
- Tủ sấy chân không OV-01, hãng sản xuất: Jeiotech, Hàn Quốc.
- Máy cô quay chân không Laborota 4001, hãng sản xuất Heidolph, Đức. - Hệ thống đo độ nhớt nội
- Máy lắc ổn nhiệt - Tủ ấm
- Tủ nung - Cân phân tích
- Các dụng cụ thí nghiệm thuỷ tinh
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu các tính chất đặc trưng của da cá tra
Thành phần hoá học bao gồm: ẩm, tro, protein, lipit và collagen.
Một số thông số nhiệt lý bao gồm: khối lượng riêng, điểm băng, nhiệt dung riêng và hệ số dẫn nhiệt.
2.2.2. Nghiên cứu quy trình tách chiết collagen từ da cá tra
Xác định các thông số thích hợp cho quy trình tách chiết bao gồm các công đoạn: - Khử các thành phần phi collagen: protein, lipit, khoáng và sắc tố.
- Chiết collagen - Kết tủa collagen
Sản xuất thử theo quy trình tìm được.
Thu sản phẩm và xác định một số tính chất của sản phẩm.
2.2.3. Xác định một số tính chất của collagen thu được từ quy trình nghiên cứu
1. Nhiệt độ biến tính
2. Bước sóng hấp thụ cực đại 3. Thành phần hoá học cơ bản
4. Thành phần và hàm lượng các acid amin 5. Khả năng bắt gốc tự do DPPH
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chung (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng phương pháp thực nghiệm, bố trí các thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng và phương pháp cổ điển; phương pháp công nghệ là phương pháp hoá-lý.
2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm:
Sử dụng phần mềm Design Expert 8.0.7.1 (DX 8) và phần mềm Microsoft Office Excel 2003.
2.3.3. Phương pháp phân tích
Sử dụng phương pháp phân tích đang được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu khoa học và đánh giá chất lượng thực phẩm của Việt Nam và thế giới.
1. Phương pháp xác định hàm lượng ẩm: theo TCVN 3700-90.
2. Phương pháp xác định hàm lượng tro toàn phần: theoTCVN 5105-90. 3. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số: theo TCVN 3705-90. 4. Phương pháp xác định hàm lượng lipit: theo phương pháp Folch.
5. Phương pháp xác định hàm lượng collagen trong da cá tra: theo phương pháp của Robert E. Neuman và Milan A. Logan [31] (Phụ lục15).
6. Phương pháp xác định nhiệt độ biến tính của collagen: theo phương pháp của HaiYing [17] và Mingyan [26] (Phụ lục 16).
7. Phương pháp xác định độ nhớt collagen: Độ nhớt của collagen được xác định bằng máy đo độ nhớt Brookfield DVII+ Pro.
8. Phương pháp xác định một số thông số nhiệt lý: thông số nhiệt lý của da cá tra được xác định bằng công thức nghiệm [28] (Phụ lục 17).
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Bố trí quy trình tổng quát tách chiết collagen từ da cá tra
Sơ đồ 2.1: Quy trình nghiên cứu dự kiến
Thuyết minh quy trình: Quy trình tách chiết collagen được xây dựng dựa trên
sự kế thừa của Trần Thị Huyền [3]. Da cá mua về từ nhà máy được rã đông, dùng dao cạo, rửa bằng nước để loại bỏ phần thịt, mỡ, máu cá còn sót lại trên da. Sau đó cắt nhỏ da cá chuẩn bị cho các công đoạn tiếp theo. Da cá đã xử lý cơ học được khử các thành phần tạp chất phi collagen bằng dung dịch NaOH, tiếp theo đem ngâm chiết trong dung dịch acid acetic. Lấy dịch chiết tiến hành kết tủa bằng muối NaCl thu được tủa collagen. Đem tủa đi sấy thu được sản phẩm collagen ở trạng thái khô. Tại các công đoạn Khử tạp chất phi collagen, Chiết collagen và Kết tủa có các thông số đầu vào cần nghiên cứu tương ứng với các công đoạn là nồng độ NaOH, CH3COOH, NaCl và thời gian thực hiện các quá trình. Các quá trình thực hiện ở 5oC được duy trì bằng cách đặt trong tủ lạnh. Da cá tra Xử lý cơ học Khử tạp chất phi collagen Chiết collagen Kết tủa collagen Sấy khô Sản phẩm Nồng độ NaOH? Thời gian xử lý? Tỷ lệ 1:10 (w/v) Nhiệt độ 50C Nồng độ CH3COOH? Thời gian chiết? Tỷ lệ 1:10 (w/v) Nhiệt độ 50C
Nồng độ NaCl? Thời gian tủa?
Rửa
Dịch chiết collagen Da cá không tan
2.4.2. Bố trí lấy mẫu và xử lý mẫu
(A) (B)
Sơ đồ 2.2: Lấy mẫu (A) và xử lý mẫu (B) da cá tra
Thuyết minh sơ đồ: Da cá tra từ nhà máy đông lạnh Thái Bình Dương thuộc Công ty Cổ phần Nam Việt được đông lạnh ở -20 ± 20C, vận chuyển và bảo quản tại phòng thí nghiệm ở nhiệt độ -20 ± 20C. Da cá trước khi tiến hành thí nghiệm được rã đông, tiến hành xử lý cơ học và phân chia thành các mẫu chuẩn bị cho từng thí nghiệm. Da cá sau khi xử lý cơ học tiếp tục được bảo quản đông cho tới khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.4.3. Bố trí thí nghiệm xác định các tính chất đặc trưng của da cá tra
Sơ đồ 2.3: Xác định các tính chất đặc trưng của da cá tra
Da cá đã xử lý cơ học
Xác định thành phần hoá học
Ẩm Tro Protein Lipit Collagen
Kết quả Thảo luận Xác định thông số nhiệt lý Nhiệt dung riêng Điểm băng Khối lượng riêng Hệ số dẫn nhiệt Kết quả Thảo luận (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đưa vào các thí nghiệm Xử lý cơ học
Bảo quản đông Da cá tra bảo quản đông Da cá tra từ Công ty Nam Việt
(An Giang)
Làm đông
Vận chuyển về phòng thí nghiệm
Thuyết minh sơ đồ: Da cá tra đã xử lý cơ học theo bố trí thí nghiệm 2.4.2 được tiến hành xác định các tính chất bao gồm:
Thông số nhiệt lý gồm có: khối lượng riêng, điểm băng, nhiệt dung riêng, hệ số dẫn nhiệt.
Thành phần hoá học gồm có: ẩm, tro, protein, lipit, collagen.
Kết quả thu được sau các thí nghiệm được xem xét, thảo luận và được xem là cơ sở để nghiên cứu các quá trình xử lý, tách chiết collagen về sau.
2.4.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hoá công đoạn khử tạp chất phi collagen bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
Mục đích của công đoạn khử tạp chất là tìm ra chế độ tách các thành phần phi collagen ra khỏi nguyên liệu hiệu quả nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết collagen sau này. Đồng thời cũng đảm bảo được hàm lượng collagen ban đầu trong da cá ít bị tổn thất nhất.
Trong công đoạn khử tạp chất phi collagen, các yếu tố tỷ lệ da cá/dung dịch là 1/10 (w/v) và nhiệt độ chiết là 5 ± 20C được kế thừa từ nghiên cứu Trần Thị Huyền [3]. Các yếu tố nồng độ NaOH và thời gian xử lý sẽ được nghiên cứu tối ưu hoá bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Các hàm mục tiêu trong công đoạn này bao gồm: hiệu suất khử protein phi collagen (%), hiệu suất khử lipit (%) và mức độ tổn thất collagen (%).
Các yếu tố ảnh hưởng và hàm mục tiêu của công đoạn khử tạp chất phi collagen được mô tả như sau:
Công đoạn khử tạp chất phi collagen
Nồng độ NaOH
Thời gian xử lý Hiệu suất khử lipit
Mức độ tổn thất collagen Hiệu suất khử protein phi collagen
Quá trình nghiên cứu công đoạn khử tạp chất phi collagen được thể hiện trong sơ đồ 2.4.
Sơ đồ 2.4: Quá trình nghiên cứu công đoạn khử tạp chất phi collagen
Giá trị biên của các yếu tố ảnh hưởng bao gồm: nồng độ NaOH (Z1) và thời gian ngâm khử (Z2) được thiết như sau:
+ Nồng độ NaOH (Z1): Z1 min =0,05 M Z1 max =0,25 M + Thời gian ngâm khử (Z2): Z2
min
= 1 ngày Z2
max
= 4 ngày
Thiết kế thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS)- phương án cấu trúc có tâm (CCD) để khảo sát ảnh hưởng của hai yếu tố đầu vào (biến độc lập) là: nồng độ NaOH (Z1) và thời gian ngâm (Z2) tới các hàm mục tiêu (biến phụ thuộc) là hiệu suất khử protien phi collagen Y1, hiệu suất khử lipit Y2 và mức độ tổn thất collagen Y3. Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng bằng mô hình CCD, các biến độc lập sẽ được đưa về dạng mã hoá theo phương trình:
Da cá tra Xử lý cơ học
Xác định hiệu suất khử lipit Xác định hiệu suất khử
protein phi collagen (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định mức độ tổn thất collagen -Nồng độ NaOH -Thời gian ngâm khử
Khử tạp chất phi collagen
Lựa chọn thông số tối ưu cho công đoạn khử tạp chất phi collagen
Xj= j j j Z Z Z 0 (*) Trong đó: j
Z là giá trị của biến độc lập thứ j
0
j
Z là giá trị trung bình của khoảng biến đổi của yếu tố Zj, 0
j Z = 2 min max j j Z Z j Z
là khoảng biến thiên của yếu tố Zj, Zj=
2 min max j j Z Z j
X là toạ độ của biến mã tương ứng với biến thực Zj
Như vậy hai biến độc lập là nồng độ NaOH (Z1) và thời gian ngâm (Z2) lần lượt được mã hoá thành X1 và X2. Các mức nghiên cứu của biến độc lập theo biến mã hoá được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các mức nghiên cứu của biến thực theo biến mã hoá
Mức nghiên cứu theo biến mã hoá Biến độc lập
- 1,414 -1 0 +1 +1,414
Nồng độ NaOH Z1 (M) 0,01 0,05 0,15 0,25 0,29
Thời gian ngâm Z2 (ngày) 0,59 1 2 3 3,41
Số thí nghiệm theo phương án cấu trúc có tâm cấp hai - hai yếu tố được tính theo công thức: N=2k+2*k+n0= 22+2*2+5=13, như vậy phương án này có 13 thí nghiệm trong đó bao gồm 4 thí nghiệm nhân tố, 4 thí nghiệm sao và 5 thí nghiệm ở tâm. Với phương án cấu trúc có tâm cấp hai - 2 yếu tố, cách tay đòn α có giá trị là 1,414. Khi đó ma trận thực nghiệm của biến mã hoá và biến thực được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Ma trận thực nghiệm công đoạn khử TCPC của biến mã hoá và biến thực
Biến mã hoá Biến độc lập Hàm mục tiêu
Thí nghiệm X 1 X2 Nồng độ NaOH (M) Thời gian ngâm (ngày) Hiệu suất khử PPC Y1 (%) Hiệu suất khử lipit Y2 (%) Mức độ tổn thất Y3 (%) 1 -1 -1 0,05 1,00 2 1 -1 0,25 1,00 3 -1 1 0,05 3,00 4 1 1 0,25 3,00 5 -1,414 0 0,01 2,00 6 1,414 0 0,29 2,00 7 0 -1,414 0,15 0,59 8 0 1,414 0,15 3,41 9 0 0 0,15 2,00 10 0 0 0,15 2,00 11 0 0 0,15 2,00 12 0 0 0,15 2,00 13 0 0 0,15 2,00
Phương trình hồi quy đầy đủ biểu diễn sự ảnh hưởng của các biến mã hoá tới hàm mục tiêu là đa thực bậc hai có dạng:
2 2 22 2 1 11 2 1 12 2 2 1 1 0 bX b X b X X b X b X b Y (**) Trong đó: Y : là hàm mục tiêu X1,X2: là các biến mã hoá b0: là hệ số tự do b1, b2: là hệ số bậc 1 b11, b22: là hệ số bậc 2
b12: là hệ số tương tác của cặp yếu tố X1, X2.
Gọi hàm mục tiêu hiệu suất khử protein phi collagen là Y1, hàm lượng protein phi collagen trước xử lý là m1, hàm lượng protein phi collagen còn lại sau xử lý là m2. Hiệu suất khử protein phi collagen được tính như sau:
% *100 1 2 1 1 m m m Y
Vậy hiệu suất khử protein phi collagen là tốt nhất khi hàm Y1 có giá trị lớn nhất. Trong công thức trên, hàm lượng protein phi collagen được tính như sau: gọi hàm lượng protien phi collagen là m, hàm lượng protein tổng số là n, hàm lượng collagen là n’ thì hàm lượng protein phi collagen ,
n n
m (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gọi hàm mục tiêu: Hiệu suất khử lipit là Y2, hàm lượng lipit ban đầu và hàm lượng lipit còn lại sau xử lý lần lượt là m1, m2 thì hiệu suất khử lipit được tính như sau:
% *100 1 2 1 2 m m m Y
Vậy hiệu suất khử lipit tốt nhất khi Y2 có giá trị lớn nhất.
Gọi hàm mục tiêu: Mức độ tổn thất collagen là Y3, hàm lượng collagen ban đầu và hàm lượng collagen còn lại sau xử lý lần lượt là m1, m2 thì mức độ tổn thất collagen được tính như sau:
% *100 1 2 1 3 m m m Y
Vậy mức độ tổn thất collagen ít nhất khi Y3 có giá trị nhỏ nhất.
Sau khi xây dựng được phương trình hồi quy miêu tả sự ảnh hưởng của các biến độc lập tới hàm mục tiêu, thông số tối ưu cho công đoạn khử tạp chất phi collagen được tìm theo phương pháp bề mặt đáp ứng với sự hỗ trợ của phần mềm DX8. Thông số tối ưu sẽ là cặp giá trị X1, X2thoả mãn nhiều nhất đồng thời ba hàm mục tiêu Y1, Y2, Y3.
Kết quả tối ưu hóa công đoạn khử tạp chất phi collagen sẽ được dùng để xử lý da cá cho quá trình tối ưu hóa các công đoạn tiếp theo.
2.4.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hoá công đoạn chiết collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng bề mặt đáp ứng
Mục đích của công đoạn chiết là dùng acid acetic để hoà tan collagen và một số thành phần khác trong da cá, những thành phần phi collagen này sẽ được loại bỏ ra
khỏi collagen trong công đoạn kết tủa. Việc tối ưu hoá công đoạn chiết nhằm tìm ra chế độ hoà tan collagen tốt nhất mà vẫn đảm bảo được chất lượng của nó.
Trong công đoạn chiết collagen, các yếu tố tỷ lệ da cá/dung dịch là 1/10 (w/v) và nhiệt độ chiết ở 5 ± 20C được kế thừa của Trần Thị Huyền [3]. Các yếu tố nồng độ acid acetic CH3COOH (M) và thời gian chiết (ngày) sẽ được nghiên cứu tối ưu hoá. Các hàm mục tiêu trong công đoạn này bao gồm: hiệu suất thu hồi collagen (%) và độ nhớt collagen (mPa.s).
Các yếu tố ảnh hưởng và hàm mục tiêu của công đoạn chiết được mô tả như sau:
Sau khi chiết, cần tiến hành kết tủa dịch chiết collagen để phân tích các hàm mục tiêu. Thông số quá trình kết tủa được tham khảo bao gồm: nồng độ NaCl 1 M [21] và thời gian kết tủa 10 phút [3]. Sơ đồ quá trình nghiên cứu công đoạn chiết được mô tả trong sơ đồ 2.5.
Giá trị biên của các yếu tố ảnh hưởng được thiết lập như sau: + Nồng độ CH3COOH (Z1): Z1 min =0,20 M Z1 max =0,80 M + Thời gian chiết (Z2): Z2
min
=1 ngày Z2
max
=4 ngày
Quá trình nghiên cứu tối ưu hoá công đoạn chiết collagen được thực hiện theo mô hình cấu trúc có tâm (CCD) để khảo sát ảnh hưởng của hai yếu tố đầu vào là nồng độ CH3COOH (Z1) và thời gian chiết (Z2) tới các hàm mục tiêu là hiệu suất thu hồi collagen Y1 và độ nhớt collagen Y2. Các yếu tố ảnh hưởng (biến độc lập) sẽ được đưa về dạng mã hoá khi thiết kế thí nghiệm theo mô hình CCD. Phương trình biến đổi các biến độc lập thành các biến mã hoá theo phương trình (*) trình bày trong mục 2.4.4.
Công đoạn chiết collagen
Nồng độ CH3COOH
Thời gian chiết Độ nhớt collagen
Hiệu suất thu hồi collagen
Sơ đồ 2.5: Quá trình nghiên cứu công đoạn chiết collagen
Như vậy hai biến độc lập: nồng độ CH3COOH (Z1) và thời gian chiết (Z2) lần lượt được mã hoá thành hai biến X1 và X2. Sử dụng mô hình CCD, các mức nghiên cứu của hai biến độc lập theo biến mã hoá được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các mức nghiên cứu của biến độc lập theo biến mã hoá ở công đoạn