- Các môi trường sử dụng trong phản ứng sinh lý, sinh hóa vi sinh vật
3.4.Nghiên cứu các ựặc ựiểm sinh học của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng
khuẩn ựối kháng
Nghiên cứu các ựặc ựiểm sinh học cơ bản của các nguồn vi khuẩn ựối kháng lựa chọn nhằm mục ựắch ựể phân loại sơ bộ các nguồn vi khuẩn ựối kháng theo các chi (genus) phổ biến, ựồng thời cung cấp thêm các thông tin về các ựiều kiện sinh trưởng và phát triển của các nguồn vi khuẩn ựối kháng lựa chọn, phục vụ cho nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học sau này.
3.4.1. đặc ựiểm hình thái của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có có triển vọng
- Nguồn P 9-1: bước ựầu qua hình thái xác ựịnh là vi khuẩn Bacillus
sp.. Trên môi trường King'B khuẩn lạc khô, dẹt, bề mặt nhăn, màu nâu nhạt, ựường kắnh 2 ọ 5mm. Vi khuẩn hình gậy, nhuộm gram dương.
- Nguồn BH 3-2:bước ựầu qua hình thái xác ựịnh là vi khuẩn. Trên mơi trường King'B khuẩn lạc tròn dẹt, nhão, mép nhăn, màu xám trong. Vi khuẩn hình gậy, nhuộm gram dương.
- Nguồn P 1- 52:bước ựầu qua hình thái xác ựịnh là xạ khuẩn Streptomyces sp. Trên môi trường YS khuẩn ty cơ chất màu xám trong, khuẩn ty khắ sinh màu nâu phát triển mạnh. Chuỗi bào tử ựơn hoặc phân nhánh dạng xoắn, mọc thành các vòng từ 2 ựến 4 chuỗi bào tử xung quanh cuống sinh bào tử, bào tử hình bầu dục.
- Nguồn BH 3-3: bước ựầu qua hình thái xác ựịnh là xạ khuẩn Streptomyces sp. Trên môi trường YS khuẩn ty cơ chất màu xám trong, khuẩn ty khắ sinh màu xám. Chuỗi bào tử thẳng hoặc cuộn tròn ở phắa ựầu, cuống sinh bào tử thường dạng thẳng và phân nhánh nhiều lần, bào tử hình bầu dục.
- Nguồn P12- 12: khuẩn lạc màu nâu, khô, ựường kắnh 1,5ọ 4mm, tế bào hình trịn.
- Nguồn BH 1- 6: bước ựầu qua hình thái xác ựịnh là xạ khuẩn
Streptomyces sp. Trên môi trường YS khuẩn ty cơ chất màu xám vàng, khuẩn ty
khắ sinh màu trắng xám. Chuỗi bào tử dài, thẳng hay lượn sóng, bào tử hình bầu dục.
- Nguồn X 7- 21: bước ựầu qua hình thái xác ựịnh là Streptomyces sp.. Trên mơi trường YS khuẩn ty cơ chất màu xám trong, khuẩn ty khắ sinh màu xám. Chuỗi bào tử thẳng hoặc cuộn tròn ở phắa ựầu, cuống sinh bào tử thường dạng thẳng và phân nhánh nhiều.
Trên cơ sở nguồn giống VSV tuyển chọn, ựề tài tiến hành các nghiên cứu xác ựịnh ảnh hưởng của các ựiều kiện môi trường nuôi cấy (pH, nhiệt ựộ,...) ựến sinh trưởng, phát triển và hoạt tắnh sinh học của các nguồn VSV.
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của một số nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn ựối kháng cao
3.4.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nhân tạo khác nhau ựến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
để tìm hiểu khả năng sinh trưởng và phát triển của các dịng vi khuẩn có triển vọng ựối với các chế ựộ dinh dưỡng khác nhau cũng như tìm hiểu mơi trường nhân tạo nào có khả năng sử dụng ựể nhân nuôi nhanh sinh khối VSV, 5 loại môi trường phù hợp với sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn và xạ khuẩn ựã ựược sử dụng. Sự sinh trưởng và phát triển của các dịng VSV có triển vọng trên các mơi trường dinh dưỡng nhân tạo ựược trình bày tại bảng 3.9.
Bảng 3.9. Sự sinh trưởng và phát triển của các dịng VSV triển vọng trên mơi trường dinh dưỡng nhân tạo (Viện Bảo vệ thực vật Ờ 2013)
Mật ựộ khuẩn lạc (108 cfu/ml) Môi trường thắ nghiệm P9 - 1 BH3 - 2 P1- 52 P12- 12 BH3 - 3 BH1- 6 X7- 21 Gause I 34,4 d1 20,2 d 294,0 a 373,7 a 279,3 a 230,8 a 286,6 a NA 282,0 a 245,2 a 105,0 c 127,4 c 118,2 c 91,8 cd 120,5 c PDA 244,8 b 228,8 b 273,3 b 244,2 b 231,7 b 219,5 b 216,0 b YS 267,9 a 236,2 a 73,6 d 106,6 d 92,6 d 86,4 d 95,0 d PSA 241,6 b 219,9 b 96,6 c 100,3 d 108,0 d 98,1 c 103,4 d CV (%) 6,9 3,6 2,8 2,2 3,0 2,5 2,8 Ghi chú:
Các giá trị trong cùng một cột biểu thị bằng các chữ giống nhau sai khác khơng có ý nghĩa ở xác suất P > 0,05 theo phân tắch DuncanỖs.
Kết quả thắ nghiệm cho thấy hai dòng vi khuẩn P9-1 và BH3-2 sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường NA và YS với mật ựộ thu ựược sau 7 ngày nhân nuôi lần lượt là 282 và 245,2(108 cfu/ml) trên môi trường NA; 267,9 và 236,2(108 cfu/ml) trên môi trường YS. Trên môi trường Gause chúng sinh trưởng kém hơn, mật ựộ thu ựược là 34,4 và 20,2(108 cfu/ml). đối với
các dịng xạ khuẩn thì mơi trường Gause phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển. Mật ựộ thu ựược ở 5 dòng xạ khuẩn thử nghiệm trên môi trường Gause là cao nhất, biến thiên từ 230,8 ựến 373,7(108 cfu/ml). Trên hai môi trường YS và PSA, các dòng xạ khuẩn phát triển kém hơn với mật ựộ thu ựược sau 10 ngày ựều thấp hơn khi so sánh với các dịng xạ khuẩn ni cấy trên mơi trường Gause. Cả 7 dịng vi khuẩn và xạ khuẩn ựều sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường PDA với mật ựộ thu ựược sau 7 ngày nuôi cấy dao ựộng từ 216 ựến 244,8(108 cfu/ml). Từ những kết quả trên, cần tiến hành thay ựổi thành phần môi trường dinh dưỡng ựể có ựược mơi trường thắch hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của 1-2 dịng vi sinh vật có triển vọng nhất, trong ựó mơi trường PDA ựược lựa chọn ựể tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng
Bảy dòng VSV ựược tuyển chọn bao gồm P9-1; BH3-2; P1- 52; P12- 12; BH3-3; BH1-6 và X7-21 ựược nuôi cấy trong ựiều kiện nhiệt ựộ 25,30, 35, 40 và 450C. Theo dõi sự phát triển của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn, kết quả ựược trình bày trong bảng 3.10. Kết quả thắ nghiệm cho thấy các ngưỡng nhiệt ựộ khác nhau ảnh hưởng có ý nghĩa ựến sự sinh trưởng và phát triển của 7 nguồn VSV tham gia thử nghiệm. Các vi khuẩn và xạ khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở khoảng nhiệt ựộ 300C khi so sánh với các ngưỡng nhiệt ựộ khác với mật ựộ bào tử thu ựược cao nhất sau 7 ngày nuôi cấy từ 219,7 ựến 308(108 bào tử/ml). Dịng xạ khuẩn X7-21 khơng phát triển ựược khi nhiệt ựộ môi trường lên ựến 400C.
Ở nhiệt ựộ 450C chỉ có 3 dịng VSV ký hiệu P9-1, BH3-2 và P12-12 có khả năng sinh trưởng và phát triển. Kết quả thắ nghiệm cũng phù hợp với các nghiên cứu cho rằng vi khuẩn và xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở nhiệt ựộ 28-300C
và ở nhiệt ựộ 450C chỉ có một số lồi vi khuẩn (Bacillus sp.) hoặc xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng và phát triển (Schaad và cộng sự, 2001).
Hình 3.4. Tắnh chịu muối (NaCl) và ựộ pH của nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ, ánh sáng ựến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn & xạ khuẩn ựối kháng có triển vọng
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến khả năng phát triển các dòng VSV tuyển chọn (Viện BVTV Ờ 2013) Mật ựộ khuẩn lạc (108 cfu/ml) Ngưỡng nhiệt ựộ (0C) P9 - 1 BH3 - 2 P1- 52 P12- 12 BH3 - 3 BH1- 6 X7- 21 25 130,4 c1 114,6 c 124,4 c 214,8 c 118,9 b 134,0 c 186,6 c 30 279,0 a 244,1 a 285,9 a 308,3 a 268,9 a 220,0 a 219,7 a 35 263,1 b 230,4 b 260,4 b 293,0 b 280,7 a 211,3 b 209,0 b 40 39,7 d 36,7 d 119,4 c 209,2 c 84,4 c 52,4 d 0,0 d 45 28,8 d 33,3 d 0,0 d 198,3 d 0,0 d 0,0 e 0,0 d CV (%) 3,7 4,4 2,9 3,9 4,0 3,7 2,8 Ghi chú:
Các giá trị trong cùng một cột biểu thị bằng các chữ giống nhau sai khác khơng có ý nghĩa ở xác suất P > 0,05 theo phân tắch DuncanỖs.
3.4.4. Ảnh hưởng của pH trong môi trường nuôi cấy ựến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng
Tiến hành nuôi cấy các nguồn tuyển chọn (P9 - 1; BH3 - 2; P1- 52; P12- 12; BH3 - 3; BH1- 6 và X7- 21 ) trên các mơi trường thắch hợp có ựộ pH khác nhau (từ 5,0 ựến 9,0). Sau 5 ngày nuôi cấy ở 300C, cho kết quả bảng 3.11.
Kết quả bảng 3.11 cho thấy các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn ựều có khả năng sinh trưởng và phát triển ở mức ựộ pH từ 5 ựến 9. Tuy nhiên ựộ pH trung tắnh từ 6-7 thì các dịng VSV này phát triển tốt hơn so với môi trường hơi chua (pH<6) và hơi kiềm (pH>7). Mật ựộ khuẩn lạc thu ựược sau 5 ngày ni cấy ở pH=7 của các dịng VSV dao ựộng từ 207,2 ựến 288(108 cfu/ml). điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước ựây và ựiều kiện này thuận
lợi khi phát triển các dòng VSV này là tác nhân sinh học ựể sản xuất chế phẩm.
Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng của các nguồn vi khuẩn, xạ khuẩn ựối kháng trong các ựiều kiện pH khác nhau. (Viện BVTV Ờ 2013)
Mật ựộ khuẩn lạc (108 cfu/ml) pH P9 - 1 BH3 - 2 P1- 52 P12- 12 BH3 - 3 BH1- 6 X7- 21 5 28,9 e 23,7 d 118,2 c 214,8 b 124,2 c 91,2 c 220,7 c 6 255,5 b 100,3 b 244,2 b 238,7 a 214,8 b 120,4 b 217,3 c 7 282,0 a 245,2 a 288,0 a 244,5 a 279,3 a 207,2 a 286,2 a 8 124,6 c 105,0 b 122,5 c 146,1 c 88,9 d 73,0 d 249,8 b 9 71,3 d 64,9 c 0,0 d 132,5 c 95,4 d 66,2 d 212.0 c CV (%) 3,9 4,9 4,0 5,2 4,1 5,5 2,5 Ghi chú:
Các giá trị trong cùng một cột biểu thị bằng các chữ giống nhau sai khác khơng có
ý nghĩa ở xác suất P > 0,05 theo phân tắch DuncanỖs.