- Các môi trường sử dụng trong phản ứng sinh lý, sinh hóa vi sinh vật
3.5. Xác ựịnh một số ựặc tắnh sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng có triển vọng
ựối kháng có triển vọng
3.5.1. Xác ựịnh tắnh yếm khắ của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng
để xác ựịnh tắnh yếm khắ của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng có có triển vọng ở trên, các VSV này ựược cấy trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc, ở ựiều kiện yếm khắ và hiếu khắ. Các vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng ựồng hóa chất dinh dưỡng theo các con ựường khác nhau, sản phẩm cuối cùng tạo ra mơi trường có tắnh axắt (màu vàng da cam) và mơi trường có tắnh bazơ (màu xanh ựậm), ựối chứng màu xanh nhạt, do sự biến ựổi màu của chất chỉ thị Bromthymol blue, kết quả thu ựược ở bảng 312. Kết quả thử khả năng
yếm khắ của các dòng VSV cho thấy tất các các dịng VSV này ựều có khả năng sinh trưởng ở ựiều kiện yếm khắ. Môi trường thắ nghiệm có VSV ựều có màu da cam khi sử dụng chất chỉ thị Bromthymol blue. Kết quả này cho phép có thể bảo quản sử dụng chúng lâu dài khi chúng ựược sử dụng ựể sản xuất chế phẩm sinh học.
Bảng 3.12. Xác ựịnh tắnh yếm khắ của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng (Viện BVTV - 2013) Tắnh yếm khắ Ký hiệu nguồn VSV Phản ứng pH Màu P9 - 1 + A xắt Da cam BH3 Ờ 2 + A xắt Da cam P1- 52 + A xắt Da cam P12 Ờ 12 + A xắt Da cam BH3 Ờ 3 + A xắt Da cam BH1- 6 + A xắt Da cam X7 - 21 + A xắt Da cam
đối chứng - Trung tắnh Xanh nhạt
Ghi chú: +: Phản ứng dương tắnh -: Phản ứng âm tắnh
3.5.2. Khả năng khử Nitrat của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
Nitrat có nhiều trong thiên nhiên (nước mưa), có một số vi sinh vật có khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nitơ và khử chúng thành NH3. Khả năng khử Nitrat là một trong những cơ sở ựể ựánh giá và phân loại vi sinh vật.
đề tài tiến hành xác ựịnh khả năng khử nitrat của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng ở trên. Vi khuẩn và xạ khuẩn ựược nuôi cấy trong mơi trường ựặc hiệu có nitrat, sử dụng thuốc thử Diphenylamin ựể kiểm tra sự có
mặt của Nitrat (xanh lam là có nitrat), nếu dương tắnh thì có sự chuyển màu, kết quả ghi nhận ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Khả năng khử nitrat của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng có triển vọng (Viện BVTV Ờ 2013) Khử Nitrat TT Ký hiệu nguồn VSV Vi khuẩn, Xạ khuẩn Phản ứng Màu phản ứng 1 P9-1 Vi khuẩn + Hồng 2 BH3 Ờ2 Vi khuẩn + đỏ 3 P1-52 Xạ khuẩn + đỏ 4 P12Ờ 12 Xạ khuẩn + Hồng nhạt 5 BH3Ờ3 Xạ khuẩn + Hồng nhạt 6 BH1 6 Xạ khuẩn + đỏ 7 X7-21 Xạ khuẩn + Hồng nhạt
8 đối chứng - Xanh lam
Ghi chú: + : Phản ứng dương tắnh - : Phản ứng âm tắnh
Kết quả cho thấy các dịng VSV ựều có khả năng khử nitrat. Tất cả các mơi trường có VSV ựều chuyển sang màu hồng nhạt hoặc màu ựỏ sau khi sử dụng thuốc thử Diphenylamin.
3.5.3. Khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon từ ựường Glucose và Sacarose của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
đánh giá khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon từ ựường Glucose và Sacarose của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng có có triển vọng. Chúng tôi sử dụng môi trường ựặc hiệu ựể ni cấy, có bổ sung 2 loại ựường trên trong môi trường. Sử dụng chất chỉ thị Bromthymol blue ựể xác ựịnh các nguồn có khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon của 2 loại ựường Glucose và
Sacarose. Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn ựều có khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon từ ựường Glucose và ựường Sacarose (bảng 3.14). Bảng 3.14. Khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon từ ựường Glucose và Sacarose của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng (Viện BVTV - 2013)
Khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon
TT Ký hiệu nguồn VSV Vi khuẩn, Xạ
khuẩn đường Glucose đường Sacarose 1 P 9 - 1 Vi khuẩn + + 2 BH 3 Ờ 2 Vi khuẩn + + 3 P 1- 52 Xạ khuẩn + + 4 P 12 Ờ 12 Xạ khuẩn + + 5 BH 3 Ờ 3 Xạ khuẩn + + 6 BH 1- 6 Xạ khuẩn + + 7 X 7 - 21 Xạ khuẩn + + Ghi chú: + : Phản ứng dương tắnh - : Phản ứng âm tắnh
3.5.4. Khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon từ tinh bột tan (Starch) và rượu Mannitol của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
đánh giá khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon từ tinh bột tan (Starch) và rượu Mannitol của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng có triển vọng, sử dụng mơi trường ựặc hiệu ựể ni cấy, có bổ sung tinh bột tan (Starch) và rượu Mannitol trong môi trường. để xác ựịnh sử dụng chất chỉ thị Bromthymol blue, kết quả thu ựược ở bảng 3.15.
Hình 3.6. Khả năng ựồng hóa nguồn Cácbon từ tinh bột tan (Starch)và rượu Manitol nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn
Hình 3.7. Khả năng ựồng hóa nguồn Các bon từ ựường Glucose và Sacarose của nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng
Bảng 3.15. Khả năng ựồng hóa nguồn Các bon từ tinh bột tan và rượu Mannitol của 7 dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng (Viện BVTV Ờ 2013)
Khả năng ựồng hóa nguồn Các bon
TT Ký hiệu nguồn VSV Vi khuẩn,
Xạ khuẩn Tinh bột tan (Starch) Rượu Mannitol 1 P 9 - 1 Vi khuẩn - + 2 BH 3 Ờ 2 Vi khuẩn - + 3 P 1- 52 Xạ khuẩn - - 4 P 12 Ờ 12 Xạ khuẩn - - 5 BH 3 Ờ 3 Xạ khuẩn - - 6 BH 1- 6 Xạ khuẩn - - 7 X 7 - 21 Xạ khuẩn - - Ghi chú: + : Phản ứng dương tắnh - : Phản ứng âm tắnh
Kết quả cho thấy chỉ có hai dịng vi khuẩn P9-1 và BH3-2 có khả năng ựồng hóa nguồn Cacbon từ rượu Mannitol, còn lại tất cả các dòng xạ khuẩn ựều khơng có khả năng ựồng hóa Cacbon từ tinh bột tan và rượu Mannitol.
3.5.5. Tắnh chịu muối (NaCl) của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
để ựánh giá khả năng chịu mặn của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựối kháng có triển vọng, môi trường ựặc hiệu ựã ựược sử dụng ựể ni cấy, có sử dụng NaCl ở nồng ựộ khác nhau 1%, 3%,5% và 7% trong môi trường. đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường sau 5 ngày, kết quả trình bày ở bảng 3.16. Kết quả thử nghiệm cho thấy ở mơi trường có nồng ựộ muối khác nhau thì sự sinh trưởng và phát triển khác nhau. Mơi trường có nồng ựộ muối 5-7% các VSV không sinh trưởng và phát triển ựược. Xạ khuẩn X7-21 và vi khuẩn
BH3-2 sinh trưởng và phát triển kém khi nồng ựộ muối trên môi trường là 1% và 3%. Xạ khuẩn P12-12 và vi khuẩn P9-1 có thể phát triển tốt trên cả hai nồng ựộ muối 1% và 3% (mật ựộ khuẩn lạc trên ựĩa lần lượt là 414,8; 344,5 và 283,7; 112,8). Các dòng VSV còn lại chủ yếu chỉ sinh trưởng trên môi trường khi nồng ựộ muối là 1%. Khi lượng muối của mơi trường tăng lên thì chúng sinh trưởng và phát triển kém dần. Kết quả này sẽ ựược sử dụng ựể lựa chọn chất phụ gia thắch hợp với các dòng VSV trong chế phẩm sinh học sau này.
Bảng 3.16. Khả năng phát triển của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn triển vọng ở các nồng ựộ NaCl thắ nghiệm (Viện BVTV Ờ 2013)
Mật ựộ khuẩn lạc trên ựĩa petri ở nồng ựộ NaCl (108 cfu/ml) TT Ký hiệu nguồn VSV Vi khuẩn, Xạ khuẩn 1% 3% 5% 7% 1 P 9 - 1 Vi khuẩn 283,7 112,8 0,0 0,0 2 BH 3 Ờ 2 Vi khuẩn 0,5 0,4 0,0 0,0 3 P 1- 52 Xạ khuẩn 317,5 1,1 0,0 0,0 4 P 12 Ờ 12 Xạ khuẩn 414,8 344,5 0,0 0,0 5 BH 3 Ờ 3 Xạ khuẩn 292,7 1,3 0,0 0,0 6 BH 1- 6 Xạ khuẩn 276,2 1,0 0,0 0,0 7 X 7 - 21 Xạ khuẩn 0,7 0,4 0,0 0,0 8 đối chứng - - - -
3.5.6. định tắnh hoạt ựộ enzym Amylaza, chitinase, β-glucanase và cellulase của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn triển vọng
Hình 3.8. định tắnh hoạt ựộ enzyme Chitinase, β-glucanase và Cellulasecủa nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng
Hình 3.9. Khả năng khử Nitrat và tắnh yếm khắ của nguồn vi khuẩn & xạ khuẩn triển vọng
Bảng 3.17. định tắnh hoạt ựộ enzyme của 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng (Viện BVTV, 2013)
đường kắnh vòng phân giải (mm)
TT Ký hiệu nguồn VSV
Amylase Cellulase Chitinase β-Glucanase 1 P 9 - 1 22,4 ổ 0,5 33,9 ổ 1,2 30,8 ổ 1,8 31,0 ổ 1,5 2 BH 3 Ờ 2 16,7 ổ 1,2 26,7 ổ 1,6 28,0 ổ 1,5 26,2 ổ 0,9 3 P 1- 52 12,7 ổ 0,5 25,0 ổ 1,0 31,0 ổ 1,3 22,8 ổ 1,0 4 P 12 Ờ 12 15,1 ổ 1,0 23,0 ổ 0,8 28,9 ổ 1,0 28,3 ổ 0,8 5 BH 3 Ờ 3 22,9 ổ 0,4 27,9 ổ 0,7 34,3 ổ 1,0 31,4 ổ 1,3 6 BH 1- 6 13,5 ổ 0,7 20,6 ổ 0,8 25,2 ổ 1,2 24,6 ổ 1,2 7 X 7 - 21 12,6 ổ 1,2 21,4 ổ 1,0 26,4 ổ 1,3 26,3 ổ 1,1 8 đối chứng 0,0 0,0 0,0 0,0
Trong 7 nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn ựã tuyển chọn ựánh giá tắnh ựối kháng ở trên, tiếp tục lựa chọn những dịng có có hoạt ựộ enzyme cao có khả năng phân giải các vi sinh vật gây bệnh. Nuôi cấy các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi trường ựặc hiệu ựo ựường kắnh vòng phân giải ựể ựánh giá hoạt tắnh các enzyme Amylase, Cellulase, Chitinase, β-Glucanase, kết quả ghi nhận ở bảng 3.17.
Các vi khuẩn và xạ khuẩn khác nhau có khả năng phân giải enzyme khác nhau thể hiện ở mức sai khác có ý nghĩa của ựường kắnh các vịng phân giải trên môi trường. đối với enzyme amylase thì xạ khuẩn BH3-3 và vi khuẩn P9-1 có hoạt tắnh cao nhất với ựường kắnh vòng phân giải ựo ựược lần lượt là 22,9 và 22,4mm. Các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn còn lại có hoạt tắnh
kém hơn, ựường kắnh vịng phân giải biến thiên từ 12,6 ựến 16,7mm. Dòng vi khuẩn P9-1 có hoạt tắnh cao nhất phân giải enzyme cellulase (33,9mm), sau ựó lần lượt là xạ khuẩn BH3-3 và vi khuẩn BH3-2. Xạ khuẩn BH3-3 và vi khuẩn P9-1 cũng là những VSV có hoạt tắnh cao phân giải enzyme Chitinase (34,3 và 30,8mm) và β Glucanase (31,4 và 31,0 mm). Các dòng VSV thử nghiệm ựều có khả năng phân giải các loại enzyme khác nhau, ựiều này rất có ý nghĩa khi chọn lọc chúng ựể sử dụng trong chế phẩm sinh học phòng trừ nấm Phytophthora gây bệnh trên cây sầu riêng.