10g ựất khô ựược khuấy ựều trong 100 ml nước cất khử trùng (w/v), lắc 30 phút, lấy 10ml dung dịch chuyển sang tuýp chứa 90ml nước cất khử trùng, ựược dung dịch có nồng ựộ pha lỗng 10-2. Tiếp tục tiến hành các bước như trên ựể có dung dịch với nồng ựộ pha lỗng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 và 10-8. Chuyển 0,5ml dung dịch có nồng ựộ 10-3 sang hộp petri có chứa mơi trường PDA (ựối với phân lập nấm) và 0,2ml dung dịch có nồng ựộ 10-7 và 10-8 sang hộp petri có chứa mơi trường NA, KB (ựối với phân lập vi khuẩn). Chan ựều dung dịch và ựể các hộp petri trong tủ ựịnh ôn ở nhiệt ựộ 280C. Kiểm tra sự
sinh trưởng và phát triển của các VSV phân lập hàng ngày. Khi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn sinh trưởng thì tách dịng thuần, tiến hành tách ựơn bào tử, khuẩn lạc, chuyển sang môi trường dinh dưỡng phù hợp và bảo quản ựể thực hiện các thắ nghiệm sau này.
2.3.2. Phương pháp ựánh giá khả năng ựối kháng của nấm có ắch với nấm
Phytophthora palmivora
2.3.2.1. Phương pháp ựánh giá khả năng ựối kháng của nấm có ắch với nấm Phytophthora palmivora trong phòng thắ nghiệm
Trong phòng thắ nghiệm: theo phương pháp cấy ựối xứng (Yoshida, 2011) Miếng khuẩn lạc (0,5mm) có nấm Phytophthora palmivora gây bệnh
trên sầu riêng ựược cấy truyền tại ựiểm giữa của hộp petri có mơi trường PDA. Sau một ngày, các VSV ựánh giá ựược cấy truyền ựối xứng trong hộp petri. Các hộp petri không cấy truyền VSV là công thức ựối chứng. đặt các ựĩa trong tủ ựịnh ôn ở nhiệt ựộ 280C. Quan sát các ựĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vịng vơ khuẩn), nghĩa là có sự ựối kháng tại ựiểm ựó. Dựa vào kắch thước vòng ức chế (D - d, mm) ựể ựánh giá hiệu lực ựối kháng của chúng. Trong ựó D là ựường kắnh tản nấm Phytophthora ở công thức ựối chứng, d là ựường kắnh tản nấm Phytophthora ở công thức thắ nghiệm. Mỗi công thức thắ nghiệm 5 lần nhắc lại (5 hộp petri). đánh giá sự ựối kháng sau 7-10 ngày nuôi cấy.
Hiệu quả ựối kháng : tắnh theo cơng thức Abbott
Trong ựó: CT: Cơng thức thắ nghiệm đC: ựối chứng
2.3.2.2. Phương pháp ựánh giá khả năng ựối kháng của nấm có ắch với nấm Phytophthora palmivora trong trong nhà lưới
CT
Hiệu quả ựối kháng (%) = ( 1 Ờ ) x 100 đC
đất thắ nghiệm trồng sầu riêng ựược hấp khử trùng trên, trộn ựều với dung dịch nấm Phytophthora palmivora ựã ựược hoạt hóa và ựược sử dụng như nguồn ựất bệnh. Sau 10 ngày, mỗi chậu có chứa ựất nhiễm nấm (2kg/chậu) ựược xử lý dung dịch VSV ựối kháng (nấm Trichoderma, vi khuẩn và xạ khuẩn) với nồng ựộ 3,5 x 107 bào tử/g ựất. Các chậu trồng sầu riêng ựược ựặt trong nhà lưới, tưới ẩm hàng ngày như ựiều kiện trồng cây ngoài tự nhiên. Thắ nghiệm ựược lặp lại 2 lần, bố trắ theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn. Thắ nghiệm gồm 4 cơng thức, 3 lần nhắc lại. Công thức ựối chứng là các chậu chỉ xử lý nước vô trùng, không xử lý VSV ựối kháng. Theo dõi mật ựộ VSV ựối kháng sau 30 ngày xử lý.
Mật ựộ nấm Phytophthora palmivora ựược kiểm tra bằng cách thả 25
cánh hoa hồng vào mỗi cốc nước có chứa dung dịch ựất thắ nghiệm và theo dõi tắnh biến màu của cánh hoa (Phạm Ngọc Dung và cộng sự, 2007).
Công thức thắ nghiệm:
CT1. Vi khuẩn ựối kháng P9-1 CT2. Xạ khuẩn ựối kháng P12-1 CT3. Nấm Trichiderma
CT4. Hỗn hợp VSV ựối kháng CT5. đối chứng (nước vô trùng)
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học, sinh thái, yếu tố ảnh hưởng ựến sinh trưởng phát triển và phản ứng sinh lý, sinh hóa của các hưởng ựến sinh trưởng phát triển và phản ứng sinh lý, sinh hóa của các nguồn VSV ựối kháng
2.3.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng ựến sinh trưởng phát triển của các nguồn VSV ựối kháng.
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo
Nhân ni nấm, sau ựó cấy truyền nấm sang hộp petri có chứa các loại mơi trường khác nhau: PCA, PDA, CMA, Czapek, V8 Juice.
Các ngưỡng nhiệt ựộ cần theo dõi: 250C, 300C, 350C, 400C và 450C. c. Nghiên cứu ảnh hưởng của các ựộ pH khác nhau
Các ngưỡng pH làm thắ nghiệm là 4, 4,5; 5; 6; 7; 8; 8,5; 9. Các chỉ tiêu chung cho thắ nghiệm trên:
+ Môi trường nuôi cấy nấm: PDA
+ điều kiện nhiệt ựộ thắ nghiệm: 280C (trừ thắ nghiệm ảnh hưởng của nhiệt ựộ)
+ Mỗi công thức thắ nghiệm làm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 3 hộp petri. + Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tốc ựộ phát triển của nấm ở các ngày thứ 2, 4, 6 sau khi cấy bằng cách ựo ựường kắnh tản nấm và mật ựộ khuẩn lạc.
2.3.3.2. Nghiên cứu các phản ứng sinh lý, sinh hóa của các nguồn VSV ựối kháng