- Các môi trường sử dụng trong phản ứng sinh lý, sinh hóa vi sinh vật
2.3.4.Chuẩn ựoán và giám ựịnh các loài VSV bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR)
học phân tử (PCR)
2.3.4.1.Chuẩn ựoán và giám ựịnh nấm Phytophthora palmivora
PCR, nhân dịng và giải trình tự
- DNA ựược chiết từ các mẫu nấm nuôi cấy trên môi trường V8 lỏng 10 % 3 ngày theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). DNA ựược hòa trong 50 uL ựệm TE và bảo quản ở -200C.
- Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) ựã ựược sử dụng ựể nhân toàn bộ vùng ITS của nấm Phytophthora palmivora. Phản ứng PCR ựược thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas với nhiệt ựộ gắn mồi ở 50 0
C.
- Sản phẩm PCR ựược tinh chiết từ gel agarose dùng kắt tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA ựược ước lượng nồng ựộ bằng ựiện di
agarose. Sản phẩm PCR tinh chiết ựược nối vào vector pTZ57R/T (Bioneer) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và ựược biến nạp vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli dòng XL1-Blue. Plasmid tái tổ hợp ựược tinh chiết dùng kit AccuPrep Plasmid MiniPrep DNA Extraction Kit (Bioneer). đoạn PCR tái tổ hợp ựược giải trình tự cả 2 chiều dùng kắt BigDyeệ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR. Sản phẩm giải trình tự ựược tinh chiết, làm khơ và gửi ựọc tại Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội. Trình tự nucleotide ựược biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
Phân tắch trình tự
Dựa trên các trình tự thu ựược, việc xác ựịnh lồi Phytophthora palmivora ựược thực hiện bằng 2 cách:
+ Tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
+ Tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu http://phytophthora-id.org/ITSBLAST. đây là cơ sở dữ liệu chuyên cho nấm Phytophthora.
2.3.4.2. Chuẩn ựoán và giám ựịnh các VSV có ắch
- DNA ựược chiết từ các mẫu vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). DNA ựược hòa trong 50 uL ựệm TE và bảo quản ở -200C.
- Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) ựã ựược sử dụng ựể nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm. Hai Mồi Phy1F và Phy1R (Hà Viết Cường và cộng sự, 2010) ựược dùng ựể nhân 1 ựoạn ~ 800 bp từ vùng mã hóa 16S RNA ribosome của vi khuẩn
- Phản ứng PCR ựược thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas với nhiệt ựộ gắn mồi ở 500C.
- Sản phẩm PCR ựược tinh chiết từ gel agarose dùng kắt tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA ựược ước lượng nồng ựộ bằng ựiện di agarose. Sản phẩm PCR ựược giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR và kắt BigDyeệ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR. Sản phẩm giải trình tự ựược tinh chiết, làm khơ và gửi ựọc tại Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội. Trình tự nucleotide ựược biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
Phân tắch trình tự
Dựa trên các trình tự thu ựược, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu thu thập ựược xử lý thống kê theo chương
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình bệnh phytophthora palmivora trên sầu riêng
đề tài ựã tiến hành ựiều tra tình hình bệnh chảy gơm và thối quả trên cây sầu riêng tại các tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu, Vĩnh Long, đồng Nai. Kết quả ựược trình bày tại bảng 3.1.
Kết quả ựiều tra cho thấy, tỉ lệ bệnh do nấm Phytophthora palmivora
trên cây sầu riêng biến thiên từ 21% ựến 30%. Bệnh trên sầu riêng xuất hiện nhiều ở các cây tuổi 8 - 10. Bệnh chảy gôm và thối quả trên cây sầu riêng ựã phá hoại và gây chết 2138 cây trong tổng số 3075 cây trồng tại huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam và gây hại trên 10% diện tắch trồng tại đồng Nai năm 2008, bệnh trên sầu riêng không làm chết cây nhưng chất lượng và năng xuất sản phẩm giảm trên 30%.
Bảng 3.1. Tình hình bệnh do nấm Phytophthora palmivora gây ra trên sầu riêng (2012)
Cây trồng địa phương Tỉ lệ bệnh
(%)
Xuân Lộc Ờ đồng Nai 21
Thị Xã Bà Rịa Ờ Bà Rịa Vũng Tàu 30
Sầu riêng
Thị Xã Vĩnh Long Ờ Vĩnh Long 25