2.2.1. Nghiên cứu trên thực nghiệm
Được thực hiện tại Bộ môn Dược lý - Trường Đại Học Y Hà Nội và Khoa Vi sinh vật Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.
+ Chất liệu và phương tiện nghiên cứu:
- Viên nang cứng HPmax do Công ty cổ phần sản phẩm thiên nhiên VINACOM sản xuất trên dây chuyền công nghệ hiện đại đạt tiêu chuẩn GMP và đạt tiêu chuẩn cơ sở được Trung tâm kiểm nghiệm Sở y tế Hà Nội cấp giấy chứng nhận.
- Ranitidin: viên nén hàm lượng 300 mg (Flamingo-India) - Cysteamin hydrochlorid tinh khiết (Sigma – Singapor)
- Aspégic (DL-lysine Acetylsalicylate) gói bột 100mg của hãng Sanofi aventis, Pháp
- Prednisolon 5mg để thử tác dụng chống viêm mạn.
- Maalox (chứa 400mg magnesi hydroxyd và 400mg nhôm hydroxyd). - Dung dịch acid acetic 1%.
- Dung dịch carragenin 1%. - Dung dịch HCl 0,1M.
- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol, creatinin và glucose của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trên máy Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy).
- Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX - Diagnostics, định lượng trên máy Vet abcTM
Animal Blood Counter. - Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.
- Môi trường nuôi cấy Helicobacter pylori Agar của BioMerieux để nuôi cấy phân lập HP.
- Môi trường Miller-Hinton (MH) để thử nghiệm hiệu quả diệt khuẩn của hoạt chất.
+ Phương tiện nghiên cứu:
- Máy định lượng sinh hóa Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy). - Máy định lượng huyết học Vet abcTM
Animal Blood Counter. - Tủ ấm 370
C có 10% CO2 để nuôi cấy HP, nỉa, đèn cồn đèn gas... - Máy scan hình ảnh
- Phần mềm tính diện tích vết loét ImageJ Basics ver 1.38 - Máy Hot plate model – DS37 của hãng Ugo-Basile (Italy) - Máy Jenway 3510 pH Meter (Anh)
2.2.1.1. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp. Nghiên cứu theo hướng dẫn của Bộ y tế và Tổ chức y tế thế giới (WHO).
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Bảy lô chuột nhắt trắng, mỗi lô 10 con, được uống thuốc thử theo liều tăng dần từ liều cao nhất không gây chết chuột đến liều thấp nhất gây chết 100% chuột, với thể tích thuốc uống hằng định mỗi lần 0,3ml/10g cân nặng, uống 3 lần/24 giờ, các lần uống cách nhau 2 giờ.
Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ (những chuột chết trong 2 giờ đầu được mổ để quan sát đại thể). Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử [117], [118], [119], [120].
Tính LD50 theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon.
2.2.1.2.Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên thỏ: Nghiên cứu theo hướng dẫn của Bộ y tế và WHO [117], [120].
Thí nghiệm được làm trên thỏ, chia thỏ thành 3 lô, có trọng lượng tương đương nhau, mỗi con nhốt riêng một chuồng, điều kiện chăm sóc và nuôi dưỡng giống nhau.
Lô chứng (n=10):Uống nước cất 3ml/ ngày.
Lô thử 1 (n=10):Uống thuốc nghiên cứu với liều (0,202g/kg), là liều dùng tương đương trên người, tính theo hệ số 3.
Lô thử 2 (n=10):Uống thuốc nghiên cứu với liều 1,010g/kg, gấp 5 lần liều dùng lô trị 1.
Thỏ được uống nước hoặc thuốc thử trong 4 tuần liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Sau 4 tuần uống thuốc, thỏ được ngừng uống thuốc và nuôi tiếp trong 2 tuần để theo dõi, đánh giá sự phục hồi (nếu thuốc thử có độc tính) hoặc khả năng gây độc tính chậm của thuốc.
. Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu: * Tình trạng chung, thể trọng cơ thể thỏ.
* Đánh giá chức phận cơ quan tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng hoạt độ enzym ALT, AST, nồng độ cholesterol, albumin, bilirubin.
* Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin trong máu. Các thông số theo dõi được kiểm tra tại 4 thời điểm: Trước khi uống thuốc, sau 2 tuần, 4 tuần uống thuốc và sau 2 tuần ngừng uống thuốc.
* Đánh giá đại thể và vi thể gan, thận: sau 30 ngày uống thuốc, 30% thỏ ở mỗi lô được giết kiểm tra (đại thể: tim, phổi, gan thận, dạ dày, ruột...Mô bệnh học gan thận), số còn lại nuôi thêm 2 tuần nữa (sau 2 tuần ngừng thuốc), sau đó kiểm tra hình ảnh đại thể và mô bệnh học như trên. Các xét nghiệm mô bệnh học được thực hiện ở trung tâm nghiên cứu và phát hiện sớm ung thư - liên hiệp các hội khoa học kỹ thuật Việt Nam.
2.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm HPmax đến HP in vitro
Đánh giá ảnh hưởng của HPmax đến HP được thực hiện theo phương pháp ức chế trực tiếp vi khuẩn, trên môi trường đặc hiệu. Kỹ thuật được thực hiện tại Khoa Vi sinh vật - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 [121], [122].
+ Sử dụng kỹ thuật đục lỗ, khuếch tán trong thạch để xác định khả năng diệt khuẩn của hoạt chất.
+ Sử dụng kỹ thuật pha loãng vi khuẩn. Các bước tiến hành:
- Các mảnh sinh thiết được nghiền nhỏ rồi ria cấy trên môi trường Helicobacter pylori agar và được nuôi cấy trong tủ ấm 370
C 10% CO2 từ 3 đến 5 ngày. Khi có khuẩn lạc xuất hiện sẽ tiến hành làm thí nghiệm.
Với kỹ thuật đục lỗ, khuyếch tán trên thạch Chuẩn bị vi khuẩn, đục lỗ
- Vi khuẩn được pha tạo thành huyền dịch 108
VK/ml, lấy láng đều lên mặt thạch MH, để khô tự nhiên.
- Dùng các trụ sắt vô trùng đục lên mặt thạch các lỗ có đường kính khoảng 5mm.
- Chuẩn bị các nồng độ chế phẩm HPmax khác nhau: pha loãng 5g, 10g, 15g, 20g hoạt chất trong 3ml nước cất vô trùng, lắc kỹ để tạo huyền dịch đồng nhất.
Dùng pipette lấy 0,5ml mỗi dung dịch pha loãng trên cho vào các lỗ đã đánh dấu sẵn trên mặt thạch.
Chờ cho hoạt chất khuyếch tán đều, đậy nắp đĩa thạch và ủ ấm 370 C có 10% CO2.
Đánh giá kết quả:
Xác định vòng vô khuẩn quanh lỗ có hoạt chất: Sau 24 - 48 giờ quan sát kỹ có hay không có vòng vô khuẩn quanh lỗ đục, đo đường kính vòng vô khuẩn. 2.2.1.4. Nghiên cứu tác dụng chống loét tá tràng trên chuột cống
Chuẩn bị mẫu thuốc cho chuột uống: nghiền kỹ lượng thuốc trong nang, hòa với nước để cho chuột uống, mỗi lần uống với thể tích là 1ml/100g, tương đương 470,0 mg cao HPmax và 50 mg ranitidin/ kg thể trọng.
Đánh giá tác dụng chống loét tá tràng của HPmax trên mô hình thực nghiệm gây loét tá tràng bằng cysteamin ở chuột cống trắng theo phương pháp của Szabo và cộng sự [123], [124].
Thiết kế nghiên cứu: 64 chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, lô chứng 10 con, 3 lô còn lại mỗi lô 18 con với tỉ lệ đực/cái như nhau ở mỗi lô. Chuột được nhịn ăn một ngày trước khi uống cysteamin.
Các lô được uống thuốc thử hoặc thuốc chuẩn như sau: - Lô 1: (Lô chứng) (n=10): Uống nước lọc 1ml/100g
- Lô 2: (Lô gây mô hình loét) (n=18): Uống nước lọc 1ml/100g/ngày trong 5 ngày đầu. Ngày thứ 6, cho chuột uống cysteamin 2 lần, mỗi lần 400mg/kg, cách nhau 4 giờ. Trước khi uống cysteamin 2 giờ, chuột được uống nước lọc mỗi lần 1ml/100g.
- Lô 3: (Lô thuốc chuẩn) (n=18): Uống nước lọc 1ml/100g/ngày trong 5 ngày đầu. Ngày thứ 6, chuột được uống cysteamin như lô 2, nhưng trước mỗi lần uống cysteamin 30 phút, chuột được uống ranitidin liều 50mg/kg.
- Lô 4: (Lô thuốc thử) (n=18): Chuột được uống HPmax liều 470,0 mg / kg/ngày trong 5 ngày đầu tiên. Ngày thứ 6, chuột được uống cysteamin như lô 2, nhưng trước mỗi lần uống cysteamin 2 giờ, chuột được uống HPmax liều như trên.
Ngày thứ 7, chuột ở các lô 1,2,3 tiếp tục được uống nước, chuột ở lô 4 được uống HPmax như trong 5 ngày đầu.
Đánh giá kết quả:
Ngày thứ 8, sau 48 giờ kể từ khi chuột uống liều cysteamin đầu tiên, chuột được gây mê bằng thiopental, mổ bụng, bộc lộ dạ dày và tá tràng. Phần ống tiêu hóa từ thực quản (sát tâm vị) đến ruột non (cách môn vị 3 - 5 cm) được cắt riêng, mở tá tràng và dạ dạy bằng kéo nhỏ theo đường đối diện với bờ mạc treo. Rửa sạch bằng nước muối sinh lý, thấm bề mặt vết loét bằng formaldehyd 10%, cố định dạ dày tá tràng trên tấm xốp bằng ghim nhỏ.
* Quan sát bằng kính lúp có độ phóng đại 10 lần, đánh giá các chỉ số sau: - Đếm số ổ loét trên bề mặt tá tràng (N: number)
- Độ sâu của ổ loét: độ sâu của ổ loét được tính điểm như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Độ 0: không loét + Độ 2: loét sâu (loét đến lớp cơ) + Độ 1: loét nông (loét đến lớp niêm mạc) + Độ 3: loét thủng.
Từ đó tính mức độ loét trung bình (S: Score) - Diện tích ổ loét (A: Area) tính theo mm2
: đặt tấm giấy bóng kính mềm trong suốt lên bề mặt ổ loét, sau đó dùng bút (nét nhỏ) vẽ lại hình dáng ổ loét theo bờ ổ loét. Hình vẽ được scan để tạo file ảnh bằng máy scan. Diện tích ổ loét trên các file ảnh được tính toán và đo đạc bằng phần mềm ImageJ Basics ver 1.38 của Viện sức khỏe quốc gia Mỹ và đã được Tổ chức Y tế thế giới công nhận.
* Tính Chỉ số loét (I: Index):
Chỉ số loét của từng chuột được tính theo công thức như sau: I = N + S + A. 10-1
Trong đó:
I (Index): Chỉ số loét N (Number): Số ổ loét
S (Score): Mức độ loét trung bình A (Area): Diện tích ổ loét trung bình.
So sánh chỉ số loét trung bình của từng lô chuột để đánh giá kết quả nghiên cứu.
* Xét nghiệm giải phẫu bệnh:
Chọn ngẫu nhiên 3 chuột ở mỗi lô để đánh giá tổn thương vi thể của tất cả các ổ loét ở tá tràng.
2.2.1.5. Nghiên cứu tác dụng chống viêm, giảm đau trên thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu tác dụng giảm đau
* Phương pháp mâm nóng
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con: Lô 1 (chứng): uống nước cất 0,2ml/10g/ngày trong 5 ngày.
Lô 2: tiêm màng bụng morphin hydroclorid liều 10mg/kg một lần trước khi đo lần thứ hai 30 phút.
Lô 3: uống HPmax liều 840mg/kg/ngày trong 5 ngày. Lô 4: uống HPmax liều 1680mg/kg/ngày trong 5 ngày
Chuột ở các lô 1, 3 và 4 được uống nước cất hoặc thuốc thử mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 5 ngày liên tục.
Đo thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột (tính bằng giây) trước khi uống thuốc và sau khi uống thuốc lần cuối cùng 1 giờ hoặc sau khi tiêm morphin hydroclorid 30 phút.
Phương pháp đo: Đặt chuột lên mâm nóng (máy Hot plate), luôn duy trì ở nhiệt độ 56o
C bằng hệ thống ổn nhiệt. Thời gian phản ứng với kích thích nhiệt được tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến khi chuột có phản xạ liếm chân sau. Loại bỏ những chuột phản ứng quá nhanh (trước 8 giây) hoặc quá chậm (sau 30 giây). So sánh thời gian phản ứng với kích thích nhiệt (tính bằng giây) trước và sau khi uống thuốc thử.
* Phương pháp gây quặn đau bằng acid acetic [125]
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con: -Lô 1 (chứng): uống nước cất liều 0,2ml/10g/ngày trong 5 ngày. -Lô 2: uống aspégic liều 100mg/kg 1 lần trước khi gây đau 1 giờ. -Lô 3: uống HPmax liều 840mg/kg/ngày trong 5 ngày.
-Lô 4: uống HPmax liều 1680mg/kg/ngày trong 5 ngày.
Chuột ở các lô 1, 3 và 4 được cho uống nước cất hoặc thuốc thử mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 5 ngày liên tục. Ngày thứ 4, sau khi uống thuốc 1 giờ, tiêm vào ổ bụng mỗi chuột 0,2 ml dung dịch acid acetic 1%. Đếm số cơn quặn đau của từng chuột trong mỗi 5 phút cho đến hết phút thứ 30 sau khi tiêm acid acetic.
Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm - Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp: 2 mô hình
* Mô hình gây phù viêm chân chuột bằng carragenin [126] Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con
- Lô 1(chứng): uống nước cất 1ml/100g thể trọng/ngày - Lô 2: uống aspégic liều 200 mg/kg/ngày
- Lô 3: uống HPmax liều 560mg/kg /ngày - Lô 4: uống HPmax liều 1120/kg /ngày
Chuột được uống thuốc hoặc nước trong 5 ngày liên tục trước khi gây viêm. Ngày thứ 5, sau khi uống thuốc 1 giờ, gây viêm bằng cách tiêm carragenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) 0,05ml/chuột vào dưới da gan bàn chân sau bên phải của chuột.
Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt vào các thời điểm: trước khi gây viêm (V0), sau khi gây viêm 2 giờ (V2), 4 giờ (V4), 6 giờ (V6) và 24 giờ (V24). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả được tính theo công thức của Fontaine:
+ Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:
100 V V V % V 0 0 t × − = ∆
Trong đó: V0 là thể tích chân chuột trước khi gây phù viêm Vt là thể tích chân chuột sau khi gây phù viêm
+ Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%) I% = 100 % % % × ∆ ∆ − ∆ c t c V V V
Trong đó: ∆Vc%: trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô chứng ∆Vt%: trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô uống thuốc
* Mô hình gây tràn dịch màng bụng
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con - Lô 1(chứng): uống nước cất 1ml/100g thể trọng/ngày
- Lô 2: uống aspégic liều 200 mg/kg/ngày - Lô 3: uống HPmax liều 560mg/kg /ngày - Lô 4: uống HPmax liều 1120mg/kg /ngày
Chuột được uống thuốc hoặc nước trong 5 ngày liên tục trước khi gây viêm. Ngày thứ 5, sau khi uống thuốc 1 giờ, gây viêm màng bụng bằng dung dịch pha như sau: 0,05g carragenin, 1,4 ml formaldehyd pha trong nước muối sinh lý vừa đủ 100ml. Tiêm vào khoang màng bụng dung dịch trên với thể tích 2 ml cho mỗi chuột.
24 giờ sau khi gây viêm, mổ ổ bụng chuột, hút dịch rỉ viêm. Đo thể tích dịch rỉ viêm, đếm số lượng bạch cầu và định lượng protein trong dịch rỉ viêm.
- Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của HPmax
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (chứng): uống nước cất liều 0,2ml/10g/ngày
- Lô 2: uống prednisolon liều 5mg/kg/ ngày - Lô 3: uống HPmax liều 840mg/kg/ngày - Lô 4: uống HPmax liều 1680mg/kg/ngày
Gây viêm mạn tính bằng cách cấy sợi amiant trọng lượng 6mg đã tiệt trùng (sấy 120o
C trong 1 giờ) được tẩm carragenin 1% vào dưới da gáy của mỗi chuột.
Sau khi cấy u hạt, các chuột được uống nước cất hoặc thuốc liên tục 9 ngày. Sau khi uống liều thuốc cuối cùng 1 giờ, tiến hành giết chuột, bóc tách khối u hạt, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 56o
C trong 18 giờ. Tính trọng lượng u hạt được sấy khô (sau khi đã trừ trọng lượng amiant) [127].
2.2.1.6. Phương pháp nghiên cứu tác dụng trung hòa acid .
Nguyên lý: Khả năng trung hòa acid được xác định bằng số lượng HCl 0,1M (ml) cho thêm vào dung dịch kháng acid, mà không làm giảm pH của hỗn hợp đó xuống dưới 3,0 [128], [129], [130].
Xác định khả năng trung hòa acid của dạng viên nén bằng cách nghiền viên nén, pha với nước.
Thuốc thử
- Viên nang cứng HPmax: nghiền kỹ bột thuốc trong 1 nang, pha trong vừa đủ 15 ml nước (liều dự kiến dùng trên người mỗi lần 3 viên).
- Maalox (chứa 400mg magnesi hydroxyd và 400mg nhôm hydroxyd): nghiền kỹ 1 viên, pha trong vừa đủ 22,5 ml nước (liều dùng trên người mỗi lần 2 viên).
Lượng thuốc trong 5 ml của cả 2 thuốc đều tương đương 1/9 liều dùng một lần của người.
. Cách tiến hành
- Lấy 5ml dung dịch thuốc thử kháng acid.
- Cho thêm dung dịch HCl 0,1M (cho nhiều ống, với số HCl tăng dần) - Đo pH của hỗn hợp để xác định số lượng HCl 0,1M đã thêm vào để đạt