PHẦN II: đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.5. Phương pháp phát hiện kháng thể LMLM trên lợn bằng ELISA FMDV NSP ELISA.
Khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể lợn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần ựể tái tạo các hạt virus mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ ựóng vai trò các men giúp cho quá trình nhân bản. Các thành phần kết hợp thành bản thân virus có tắnh kháng nguyên gọi là protein cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp
thành virion mới và có tắnh kháng nguyên gọi là protein không cấu trúc (non- structure protein)
Trong các protein không cấu trúc của virus LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tắnh kháng nguyên rất cao, nó kắch thắch cơ thể gia súc tạo ra kháng thể ựặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh lợn bị nhiễm. Do ựó việc phát hiện kháng thể ựặc hiệu 3ABC (NSP) cho phép kết luận lợn ựang bị nhiễm virus LMLM.
*Phương pháp xét nghiệm
đĩa ELISA ựược phủ kháng nguyên 3ABC của virus LMLM, kháng nguyên có ựộ tinh khiết cao ựược sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp. Kit xét nghiệm: VDPro FMDV NSP AB ELISA (Cat.No.FMDV-NSP; lot 107SD355 - MEDIAN).
- Bước 1: Pha loãng mẫu với tỷ lệ 1: 5, lấy 20ộl huyết thanh lợn và ựối chứng âm, dương + 80ộl sample diluent. Rồi cho 100ộl/ giếng vào ựĩa phủ kháng nguyên 96 giếng, phủ kắn ựĩa, ủ trong 60 phút ở nhiệt ựộ phòng (180C - 250C).
- Bước 2: Rửa 3 lần mỗi lần 300ộl washing solution, làm khô ựáy giếng.
- Bước 3: Cho 100ộl conjugate vào mỗi giếng, phủ kắn ựĩa và ủ trong 60 ở
nhiệt ựộ phòng.
- Bước 4: Rửa 3 lần, mỗi lần 300ộl washing solution, làm khô ựáy giếng.
- Bước 5: Cho 100ộl Subtrate vào mỗi giếng, phủ kắn ựĩa và ủ 15 ở nhiệt ựộ
phòng.
- Bước 8: Cho 50ộl stop solution vào mỗi giếng và ựọc kết quả phản ứng bằng máy ựọc ELISA với bước sóng 450nm.
- đánh giá kết quả theo công thức
+ SN = OD mẫu/OD ựối chứng âm.
+ Nếu SN ≤ 0,6 thì mẫu ựược coi là dương tắnh. + Nếu SN > 0.6 thì mẫu ựược coi là âm tắnh.
Sơ ựồ xét nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N N 7 7 B P P 8 8 C 1 1 9 9 D 2 2 10 10 E 3 3 F 4 4 G 5 5 45 45 H 6 6 46 46 N = ựối chứng âm P = ựối chứng dương 2.4.6. Phương pháp RT-PCR
RT-PCR là phản ứng chuyển ựổi ARN thành ADN rồi nhân bản vùng gen cần nghiên cứu.
đối với gene ựắch ở vùng không mã hóa, sử dụng cặt mồi R1-F1 universal, cho phép nhân gene ựặc hiệu với cả 7 type virus LMLM. Cặp mồi này có trình tự nucleotide:
Mồi Fmdv-Uni-1F: 5Ỗ GCCTGGTCTTTCCAGGTC 3Ỗ (18 nucleotid)
Mồi Fmdv-Uni-1R: 5Ỗ CCAGTCCCCTTCTCAGATC 3Ỗ (19 nucleotid)
Cặp mồi Fmdv-Uni-1F-1R ựược sử dụng ựề nhân vùng gen không mã hóa 5ỖUTR từ nguồn khuôn ARN của các chủng type O, A, C và Asia 1, cho sản phẩm ADN có ựộ dài khoảng 323-328 nucleotide tùy thuộc type virus.
đối với gene ựắch 1D mã hóa cho VP1, mồi ựặc hiệu của cả 3 type chung là ựoạn mồi ngược có trình tự:
NK61 (R): 5Ỗ GACATGTCCTCCTGCATCTG 3Ỗ
ARS4 (F): 5Ỗ ACCAACCTCCTTGATGTGGCT 3Ỗ
AS1-1C505: 5Ỗ TACACTGCTTCTGACGTGGC 3Ỗ
NK61 (R): 5Ỗ GACATGTCCTCCTGCATCTG 3Ỗ
- Thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA, sử dụng quy trình thường quy của Bộ môn Hóa Sinh - Miễn Dịch - Bệnh Lý, Viện Thú y trong ựó TRIzol do hãng Invitrogen (Cat. 15596-26), Random primer (Cat C118A) và Reverse Transcriptase do hãng Promega cung cấp; hoặc tổng hợp cDNA sử dụng kit tách ARN (Qiagen cat 741060), phản ứng ựược tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bộ kit và hóa chất dùng cho phản ứng PCR nhân gene do hãng Invitrogen cung cấp: Superscrip III/Platinum Taq Mix (5U/ộl) Invitrogen Catalog No.12547-018. Thực hiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.