PHẦN II: đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm virus gây bệnh LMLM
2.4.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào BHK-21
Tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney-21) ựược nuôi cấy bằng môi trường DMEM (DulbeccoỖs Modified Eagle,s Medium) có bổ sung kháng sinh, chất chống nấm và 10% huyết thanh bào thai bê (FCS). Sau khi ra chai, tế bào BHK -21 phát triển nhanh và phủ kắn bề mặt của bình nuôi sau 24 giờ.
2.4.2.2. Phương pháp tách tế bào bám dắnh (Tripsin hoá)
Sau khi tế bào mọc dày thành một lớp (khoảng 48 giờ), tiến hành tách tế bào theo các bước sau: Gạn bỏ môi trường cũ. Hút PBS hoặc Trypsin Ờ EDTA với liều ựể ựạt 0,1ml/cm2, ủ trong tủ ấm 370C. Sau 5-15 phút, tế bào bong ra hết. Bổ sung ngay môi trường có chứa huyết thanh, vỗ mạnh nhiều lần vào thành chai. Dùng pipet ựánh rời sơ bộ các tế bào sau ựó hút hết vào
ống Corning 15ml và li tâm 1500 Ờ 2000 vòng/1 phút trong thời gian 10 phút, ở nhiệt ựộ 40C. Hút bỏ dịch nổi sau khi li tâm, giữ lại cặn. Hòa tan cặn tế bào trong 5ml môi trường rồi dùng quả bóp ựánh mạnh nhiều lần ựể tế bào tách rời nhau hoàn toàn. đếm tế bào: hòa 100ộl dịch chứa tế bào vào 100ộl Trypan blue trộn ựều rồi ựếm trên buồng ựếm hồng cầu. Khi ựã biết ựược lượng tế bào có trong 1ml dung dịch (5x105 - 5x106 tế bào/1ml) hút 0.2ml dịch chứa tế bào/cm2 diện tắch ựáy chai nuôi và tiếp tục nuôi. Tùy theo mục ựắch sử dụng tế bào mà ra chai với diện tắch ựáy chai phù hợp hoặc nuôi trên ựĩa nhựa 96 lỗ.
2.4.2.3. Phương pháp gây nhiễm virus LMLM lên tế bào BKH-21
Bệnh phẩm nghi ựã chuẩn bị bằng cách nghiền mẫu trong cối, chày sứ và bổ sung PBS vào mẫu ựể tạo thành dung dịch 10%. Rửa thảm tế bào trong chai nuôi cấy bằng dung dịch PBS vô trùng hoặc bằng môi trường duy trì, sau ựó hút sạch phần môi trường rửa ựi. Hút 7-10ml hỗn dịch bệnh phẩm sau khi ựược pha loãng theo tỷ lệ 1/5 với môi trường duy trì vào chai nuôi cấy tế bào ựã chuẩn bị ở trên. Tiếp tục ựem nuôi cấy trong tủ ấm 370C có CO2. Cấy chuyển mù: Trong trường hợp sau gây nhiễm ựầu tiên, khi quan sát không thấy CPE, có thể cấy chuyển mù từ 3 ựến 5 lần.
