b. Kiểm tra phản ứng của da và kháng thể trung hoà (PD50) ở 25 ngày sau gây nhiễm 1.3.2.2 Gây nhiễm trên bò và lợn:
1.6.2. Chẩn ựoán phòng thắ nghiệm
1.6.2.1. Chẩn ựoán virus học
Dùng huyễn dịch bệnh phẩm nghi là có chứa virus LMLM (mụn nước, biểu mô) nuối cấy trên tế bào mẫn cảm (tế bào thận bê, BKH-21...) hoặc tiêm vào ựộng vật thắ nghiệm (chuột lang, bê...) rồi theo dõi sự biến ựổi của tế bào hoặc triệu chứng, bệnh tắch của ựộng vật thắ nghiệm, ựể xác ựịnh trong bệnh phẩm có chứa virus LMLM hay không (Nguyễn Như Thanh, 1974).
Tiêm cho chuột: Dùng chuột nhắt trắng 2-7 ngày tuổi và thuần chủng, khắa gan bàn chân chuột, bôi huyễn dịch bệnh phẩm lên vùng da bị khắa. Nếu bệnh phẩm có chứa virus LMLM, sau 12 giờ sẽ nổi vết ựỏ, có thuỷ thũng và ựau ở chỗ khắa (Tô Long Thành, 2000)..
Nuôi cấy trên tế bào: Các tế bào nhạy cảm với virus LMLM bao gồm tế bào tuyến giáp trạng bò sơ cấp, tế bào thận cừu sơ cấp, thận bê hoặc thận lợn sơ cấp các tế bào dòng, vắ dụ như tế bào thận chuột Hamster một ngày tuổi (BHK- 21), sau 24 giờ nếu bệnh phẩm có virus LMLM thì sẽ thấy bệnh tắch tế bào (Tô Long Thành, 2000).
Tiêm ựộng vật cảm thụ: Tiêm vào nội bì lưỡi bò (bò không nằm trong phạm vi ổ dịch, chưa ựược tiêm phòng văc xin), sau 24 giờ nếu xuất hiện mụn nước ở chỗ tiêm, khi mụn nước tạo ra các vết loét thì kết luận gia súc bị bệnh.
1.6.2.2. Chẩn ựoán bằng phương pháp huyết thanh học
* Chẩn ựoán bằng phản ứng kết hợp bổ thể
Nguyên lý của phản ứng: Phản ứng kết hợp bổ thể dùng hai hệ thống: Hệ thống dung khuẩn và hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể.
- Hệ thống dung khuẩn gồm: huyết thanh kháng 1 trong 7 type virus LMLM ựã ựược diệt bổ thể và huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn ựoán.
- Hệ thống dung huyết gồm: hồng cầu cừu và huyết thanh miễn dịch kháng hồng cầu cừu ựã ựược diệt bổ thể ở 560C trong 30 phút.
- Bổ thể là huyết thanh chuột lang tươi.
Huyết thanh miễn dịch của từng type ựược chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch. Tiêm văc xin LMLM của từng type virus LMLM khác nhau vào trong da dưới gan bàn chân chuột lang (mỗi type một chuột) hai lần, mỗi lần cách nhau một tháng, sau ựó lấy máu, chắt huyết thanh có chứa kháng thể.
Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc bệnh phẩm cấy vào trong môi trường tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các dòng tế bào có ựộ nhạy tương ựương, khi tế bào xuất hiện nhưng dấu hiệu bệnh tắch tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp bổ thể (Nguyễn Như Thanh, 2001).
Phản ứng ựược tiến hành trong ống nghiệm vô trùng, kết quả ựược ựánh giá dựa trên cở sở có hay không hiện tượng dung huyết.
Theo Tô Long Thành (2000), tóm tắt nguyên lý phản ứng: kháng huyết thanh của một trong 7 type virus LMLM ựược pha loãng trong dung dịch ựệm veronal theo bậc 1,5; bắt ựầu từ ựộ pha loãng 1/16, thể tắch dùng trong phản ứng là 25ộl. Thêm vào 50ộl có chứa 3 ựơn vị bổ thể, sau ựó thêm 25ml huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn ựoán. Cuối cùng thêm 25ml dung dịch hồng cầu ựã pha loãng. Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể là nghịch ựảo ựộ pha loãng của huyết thanh tạo nên dung huyết 50%. Hiệu giá của phản ứng kết hợp bổ thể lớn hơn 36 ựược coi là phản ứng dương tắnh.
Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng thông thường ựược dùng ựể phát hiện bệnh LMLM, vì ựơn giản, cho kết quả nhanh, chắnh xác và ắt tốn kém.
* Chẩn ựoán bằng phản ứng ELISA
Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym không bị rửa trôi, enzym sẽ phân hủy cơ chất tạo nên màu, khi so sánh màu trong quang phổ kế sẽ ựịnh lượng ựược mức ựộ phản ứng (Nguyễn Như Thanh, 2002).
Phản ứng ELISA trực tiếp (direct ELISA): Dùng kháng thể gắn enzym ựể xác ựịnh kháng nguyên nghi cố ựịnh trên ựĩa chuyên dụng.
Phản ứng ELISA gián tiếp (indirect ELISA): Dùng kháng nguyên chuẩn và kháng kháng thể gắn enzym ựể phát hiện kháng thể nghi.
ELISA là một phản ứng chẩn ựoán nhanh dùng cho bệnh LMLM cũng như giám ựịnh serotype của virus LMLM.
* Chẩn ựoán bằng phản ứng trung hòa virus
Nguyên lý: Virus LMLM khi xâm nhập vào cơ thể kắch thắch cơ thể sản sinh kháng thể dịch thể ựặc hiệu. Sự kết hợp giữa kháng thể dịch thể ựặc hiệu và virus LMLM làm cho virus LMLM bị trung hoà, mất khả năng lây nhiễm. Phản ứng trung hòa virus ựược thực hiện trên môi trường tế bào tổ chức thận lợn hoặc thận cừu, hoặc tế bào mẫn cảm BHK-21, ựược nuôi trong các ựĩa nhựa lỗ nhỏ. Kháng thể nghi là huyết thanh của gia súc bệnh ựược xử lý ở nhiệt ựộ 560C trong 30 phút.
Trong chẩn ựoán bệnh LMLM, phản ứng trung hòa dùng kháng nguyên chuẩn là 7 serotype virus LMLM sống ựể xác ựịnh kháng thể nghi là huyết thanh của con vật nghi mắc bệnh.
để xác ựịnh type gây bệnh, cho huyết thanh cần chẩn ựoán vào 7 ống nghiệm, sau ựó cho vào mỗi ống nghiệm từng type virus LMLM ựã biết với hiệu giá virus ựã ựược xác ựịnh là 100TCID50 một lượng tương ựương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm 37ỨC trong vòng 1 giờ. Sau
ựó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy lỗ nhựa ựã nuôi cấy tế bào ựể ựánh giá khả năng trung hòa của huyết thanh. Sau khi ựã xác ựịnh ựược type virus gây bệnh, tiếp tục pha loãng huyết thanh nghi và làm phản ứng tương tự ựể xác ựịnh hiệu giá kháng thề có khả năng trung hòa virus (Tô Long Thành, 2000).
Phản ứng trung hòa rất có gắ trị trong các trường hợp bệnh diễn ra ở thể nhẹ, không có ựiều kiện lấy mẫu bệnh phẩm là mụn nước mà lấy máu ựể tìm ra kháng thể.
1.6.2.3. Chẩn ựoán bằng phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR ựược Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985. đây là phương pháp tạo dòng invitro cho phép khuyếch ựại một vùng ADN ựặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và khổng lồ mà không cần ựến việc tách và nhân dòng. Với những ARN virus thì trước tiên cần thực hiện phản ứng sao chép ngược nhờ men sao chép ngược RT ựể chuyển ARN thành cDNA. Sau ựó tiến hành phương pháp PCR như các quy trình thông thường (Tô Long Thành và cộng sự, 2004).
Nguyên lý của phản ứng PCR dựa vào ựặc ựiểm sao chép ADN. ADN polymerase sử dụng các ựoạn ADN mạch ựơn ựể tổng hợp nên sợi bổ sung mới.
Tất cả các ADN polymerase khi hoạt ựộng ựể tổng hợp nên sợi ADN
mới từ mạch khuôn thì ựều cần có sự hiện diện của những cặp mồi (Primer)
ựặc hiệu ựể khởi ựầu cho quá trình tổng hợp.
Mồi là những ựoạn ADN ngắn (thường có ựộ dài từ 6-30 nucleotid) có khả năng bắt cặp bổ sung với một ựầu của ADN sợi khuôn, enzyme ADN polymarase sẽ kéo dài mồi ựể tạo thành sợi ADN mới. để khuyếch ựại một trình tự ADN xác ựịnh thì phải có ựược thông tin về trình tự gen của nó ựủ ựể tạo mồi chuyên biệt. Một cặp mồi gồm có một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer).
cần ựược chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase ựể có thể nhân gen ựặc hiệu trong PCR.
Phương pháp RT-PCR cho phép xác ựịnh type của virus LMLM. đây là phương pháp chẩn ựoán cho kết quả nhanh, chắnh xác với ựộ nhạy cao và ngày càng ựược sử dụng rộng rãi ựối với bệnh LMLM ở Việt Nam cũng như trên thế giới.
