PHẦN II: đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.3. Chuẩn ựộ virus LMLM trên tế bào BHK-
2.4.3.1. Chuẩn bị
- Chuẩn bị môi trường: Môi trường DMEM không ựầy ựủ có bổ sung 1% kháng sinh, kháng nấm. Môi trường DMEM duy trì có bổ sung 1% huyết thanh bào thai bò và 0,1% kháng sinh, kháng nấm.
- Chuẩn bị virus: Virus LMLM type O ựã ựược tăng cường trên môi trường tế bào BHK-21. Li tâm virus 13000v/15phút, pha loãng virus trên eppendorf tube theo
cơ số 10 từ 10-1 ựến 10-8 trong môi trường DMEM không ựầy ựủ. Quá trình pha loãng ựược tiến hành theo sơ ựồ:
Cho vào các tube từ 1 Ờ 8 mỗi tube 900ộl môi trường DMEM không ựầy ựủ. Lấy 100ộl huyễn dịch virus vào tube 1, trộn ựều; Lấy 100ộl huyễn dịch virus từ tube 1 chuyển sang tube 2, trộn ựều, làm tương tự ựến tube 8.
- Chuẩn bị tế bào: Tế bào BHK-21 ựược nuôi cấy trên ựĩa 96 giếng, bao phủ 70% ựáy giếng.
Sơ ựồ thực hiện chuẩn ựộ virus:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A đCTB 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 đCTB B đCTB 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 đCTB C đCTB 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 đCTB D đCTB 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 đCTB E đCTB 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 đCTB F đCTB 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 đCTB G đCTB 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 đCTB H đCTB 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 đCTB
Ghi chú: đCTB: đối chứng tế bào, không gây nhiễm virus.
2.4.3.2. Các bước tiến hành
Bước 1. Gây nhiễm virus trên tế bào BHK-21: Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong ựĩa 96 giếng; Rửa tế bào bằng dung dịch PBS-, 150ộl/giếng, loại bỏ.
Chuyển 100ộl virus ựã pha loãng lần lượt vào các giếng tương ứng trên ựĩa tế bào, ựối chứng tế bào (đCTB) cho 100ộl môi trường DMEM duy trì vào mỗi giếng. Ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 30 phút.
Tube số 1 2 3 4 5 6 7 8
DMEM (ộộộộl) 900 900 900 900 900 900 900 900
Virus (ộộộl) ộ 100 100
độ pha loãng
Bước 2. Thay môi trường: Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng; Rửa tế bào bằng dung dịch PBS-, 150ộl/giếng, loại bỏ PBS; Cho 150ộl/giếng môi trường DMEM duy trì. Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2.
Bước 3. Theo dõi sự biến ựổi của tế bào BHK-21 hàng ngày (trong 5 ngày), ghi nhận giếng có CPE.
2.4.3.3. Xác ựịnh TCID50
TCID50 ựược xác ựịnh như là ựộ pha loãng (hay ựậm ựộ) ở ngưỡng cần thiết của một huyễn dịch virus xác ựịnh vừa ựủ ựể gây nhiễm ựược 50% tế bào cảm thụ. Việc xác ựịnh trị số TCID50 dựa vào tác ựộng huỷ tế bào của virus CPE và việc xác ựịnh ựược CPE trong thắ nghiệm chuẩn ựộ. Quan sát dưới kắnh hiển vi và ựếm số giếng có CPE, số liệu tuyệt ựối ựược chép vào bảng và xử lý theo phương pháp của Spearman Karber (Spearman, 1908; Karber, 1931).
Gọi Ep50 (Endpoint 50%, ựiểm ngưỡng cuối 50%) là trị số (ở) cần xác ựịnh cho 1 thể tắch huyễn dịch virus xác ựịnh có chứa bao nhiêu ựơn vị (TCID50) gây nhiễm 50% ựối tượng cảm thụ.
Gọi X là logarit cơ số 10 của ựộ pha loãng virus tại ựó huyễn dịch có ựậm ựộ virus cao nhất trong test cho 100% số giếng có CPE.
Gọi Nx là tổng số giếng có CPE trong test. Gọi n là số giếng của mỗi ựộ pha loãng.
Ep50 = X + 1/2 - (Nx/n)= λ TCID50 unit 0.1 ml-1.
