3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.5.Phòng bệnh
Chưa có vaccin hữu hiệu để phòng bệnh PTH cho vịt. Do đó, các loại thuốc kháng sinh thường được dùng trong phòng và chữa bệnh một cách có hiệu quả. Hãy chủ động dùng liều phòng cho vịt con ăn thường xuyên từ lúc bóc trứng đến khoảng 2 tuần tuổi thì ngăn chặn được bệnh, giảm tỷ lệ vịt con chết do bệnh này và nhiều bệnh tiêu chảy khác ở vịt con.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phòng bệnh rất có ý nghĩa và liên quan đến chế độ chăm sóc, vệ sinh và nuôi dưỡng vịt ở những tuần tuổi đầu. Có chế độ nuôi vịt giống, sử lý và vệ sinh trứng, lồng ấp trước khi đưa trứng vào ấp. Diệt nấm, khử trùng máy ấp bằng Formol sẽ có tác dụng tốt chống nhiễm Salmonella xâm nhiễm qua vỏ trứng. Vệ sinh thú y: sát trùng chuồng trại sau mỗi đợt xuất gà, thường xuyên tẩy uế máng ăn, máng uống.
1.6. Điều trị
Điều trị bằng thuốc
Hiện nay, vi khuẩn Salmonella có khả năng kháng lại rất nhiều loại thuốc kháng sinh. Do vậy, việc điều trị bệnh PTH vịt bằng kháng sinh phải dựa trên kết quả thử phản ứng kháng sinh đồ mới mang lại hiệu quả điều trị. Sử dụng kháng sinh thích hợp có tác dụng làm giảm tỷ lệ chết ở một số ổ dịch, hạn chế tỷ lệ mang trùng trong đàn, ngăn ngừa được tình trạng ô nhiễm môi trường do hiện tượng bài trùng trong thời kỳ bệnh và giai đoạn hồi phục.
Việc sử dụng kháng sinh để điều trị con vật mang trùng cần được bố trí thích hợp để tiêu diệt căn bệnh trong đường ruột cũng như trong tế bào đã tạo ra hàng rào phòng vệ chống lại tác động của thuốc diệt khuẩn, lúc này các yếu tố đề kháng không đặc hiệu của cơ thể vật chủ có vai trò quan trọng trong quá trình đề kháng với mầm bệnh.
Dung dịch nước sinh lý, chất điện giải có ý nghĩa rất lớn trong quá trình điều trị giúp cho cơ thể con vật đang điều trị bệnh duy trì cân bằng muối và nước, đặc biệt là những con bệnh trong tình trạng ỉa chảy, mất nước, thiếu máu nặng.
Tuy vậy, việc điều trị không phải lúc nào cũng mang lại kết quả như mong muốn nhất là các bệnh tiến triển nhanh như bệnh nhiễm trùng huyết, bại huyết và nhiễm độc huyết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Điều trị bằng kháng huyết thanh
Điều trị bằng kháng huyết thanh là một trong những phương pháp điều trị nhanh nhất, có hiệu quả nhất, đặc hiệu nhất và cũng đắt tiền nhất. Khi ta đưa một lượng nhất định kháng huyết thanh đặc hiệu vào cơ thể con vật tức là ta đẵ đưa một lượng kháng thể đặc hiệu với mục đích tạo miễn dịch bị động cho con vật, lúc đó sẽ gây nên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể do vậy có thể loại bỏ được mầm bệnh nhanh nhất.
Hiện nay, việc sử dụng kháng huyết thanh để phòng và chữa bệnh PTH vịt chưa được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Vi khuẩn S. typhimurium và S. enteritidis trên vịt.
2.1.2. Vật liệu dùng trong nghiên cứu
2.1.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Lách, manh tràng của vịt con, vịt thịt và vịt đẻ. Trứng trắng dị hình, trứng lộn sát tắc.
Nước tại môi trường chăn nuôi.
2.1.2.2. Vật liệu khác
- Các loại môi trường, hoá chất cần thiết cho nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella.
+ Môi trường tăng sinh không chọn lọc: dung dịch đệm BPW. + Môi trường tăng sinh chọn lọc: Mueller Kauffmann
+ Môi trường kiểm tra đặc tính di động của vi khuẩn Salmonella: MSRV. + Môi trường phân lập: XLT4, Rambach.
- Các loại thuốc nhuộm và thuốc thử phản ứng sinh hoá. - Các loại đường để thử phản ứng lên men.
- Kháng huyết thanh chuẩn để định typ vi khuẩn Salmonella + Kháng huyết thanh đơn giá O.
+ Kháng huyết thanh đơn giá H.
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng 20 - 25g/con.
- Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm vi sinh vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Máy dập mẫu Stomacher.
+ Dụng cụ: pipet, ống nghiệm, chai lọ các loại,… và hoá chất cần thiết trong phòng thí nghiệm.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Lấy mẫu tại các trang trại, hộ chăn nuôi vịt trên hai tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang.
- Quá trình xét nghiệm, phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella
được thực hiện tại Bộ môn Vệ sinh gia súc - Viện thú y.
2.1.4. Thời gian thực hiện đề tài
Từ tháng 10/2008 đến tháng 12/2009.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trên vịt tại địa bàn nghiên cứu. - Xác tỷ lệ nhiễm Salmonella trên vịt theo mùa vụ.
- Nuôi cấy phân lập và xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng Salmonella phân lập được.
- Xác định typ Salmonella phân lập được.
- Xác định kháng nguyên bám dính của các chủng Salmonella phân lập được. - Xác định khả năng sản sinh độc tố của các chủng Salmonella phân lập được. - Xác định độc lực các chủng Salmonella phân lập được.
- Xác định LD50 của các chủng Salmonella phân lập được từ vịt.
- Xác định khả năng gây bệnh của một số chủng Salmonella phân lập được. - Xác định khả năng kháng kháng sinh của một số chủng Salmonella
phân lập được.
- Thử nghiệm một số phương pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra trên vịt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu bệnh phẩm: vịt con, vịt thịt và vịt đẻ bị tiêu chảy hoặc sắp chết hoặc chết nghi bệnh PTH; mổ khám tại chỗ, lấy bệnh phẩm (lách và manh tràng), bảo quản mẫu trong phích đá; vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm và tiến hành xét nghiệm; các mẫu chưa thực hiện xét nghiệm, được bảo quản lạnh 0 - 40C, nhưng không quá 24 giờ kể từ lúc thu thập. Mỗi loại bệnh phẩm được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ, lứa tuổi vịt...
Mẫu trứng trắng: mỗi trại lấy 15 quả trứng méo, dị hình, bảo quản về phòng thí nghiệm. Mỗi loại bệnh phẩm được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ trại và lò ấp cung cấp...
Mẫu trứng lộn: lấy tại lò ấp, trước khi lấy hỏi rõ nguồn gốc, địa chỉ trại cung cấp trứng ấp. Lấy 20 quả trứng sát tắc từ mỗi trại, bảo quản cẩn thận mang về phòng thí nghiệm. Mỗi loại bệnh phẩm được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ trại và lò ấp cung cấp..
Mẫu nước tại môi trường chăn nuôi: lấy khoảng 250 ml nước một cách ngẫu nhiên tại môi trường chăn nuôi vịt. Mỗi trại lấy 03 mẫu. Mỗi loại mẫu được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ...
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Theo ISO 6579
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc.
Mẫu bệnh phẩm lách: lấy lách mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18 h.
Mẫu bệnh phẩm manh tràng: vô trùng bên ngoài manh tràng rồi dùng kéo và panh tuốt phân trong manh tràng cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18 h.
Mẫu là trứng trắng và trứng lộn: lấy 25g mẫu (lấy phần lòng đỏ và phần noãn hoàng) cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18h. Mẫu là nước môi trường chăn nuôi: lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10. Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút. Để tủ ấm 37o
C trong vòng 16-18h. Bước 2: Tăng sinh chọn lọc.
Dùng pipet vô trùng hút 1-1,2ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc, nhỏ 3 giọt vào thạch bán cố thể MSRV (để kiểm tra sự di động của vi khuẩn
Salmonella), để vào tủ ấm 41.50
C/24-48 h. Còn lại cho vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trường Muller Kauffmann, dùng máy (vortex) lắc đều, để vào tủ ấm 370
C/18-24 h.
Đọc kết quả: trên môi trường MSRV vi khuẩn mọc lan ra xung quanh giọt canh khuẩn. Ở môi trường Muller Kauffmann hỗn dịch có thể biến đổi màu sắc.
Bước 3: Phân lập trên các môi trưòng chọn lọc
Dùng que cấy có đường kính 1μm lấy 1 vòng canh trùng từ môi trường MSRV (lấy ở vị trí vi khuẩn lan xa nhất) ria cấy sang đĩa thạch Rambach, để tủ ấm 370
C/18 - 24 h. Khuẩn lạc Salmonella tròn trơn, nhẵn bóng, có màu đỏ hoặc hồng cánh sen.
Dùng que cấy có đường kính 10 μm lấy 1 vòng canh trùng từ ống tăng sinh Muller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc đều hỗn dịch trong ống) ria cấy sang đĩa thạch XLT4. Cấy làm 3 đường cấy và thưa dần để tách
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
khuẩn lạc riêng rẽ. Để tủ ấm 370
C/18 - 24 h. Khuẩn lạc Salmonella tròn, bóng lồi lên trên bề mặt thạch, có màu đen
Bước 4: Kiểm tra tính chất sinh hoá
Từ môi trường XLT4 và môi trường Rambach chọn ra khuẩn lạc điển hình kiểm tra đặc tính sinh hoá trên môi trường Kligler, ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy chích sâu ở phần thạch đứng xuống tận đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37o
C/18-24 h, sau đó đọc kết quả:
+ Nếu phần thạch nghiêng có màu hồng: lactose âm tính. + Nếu phần thạch đứng có màu vàng: glucose dương tính. + Nếu có bọt khí: sinh hơi dương tính.
+ Nếu dọc đường cấy trích sâu có màu đen: H2S dương tính.
Những mẫu có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella trên môi trường Kligler (Lên men đường glucose, không lên men đường lactose, sinh hơi, H2S dương tính) được cấy kiểm tra vào: urease, LDC (nuôi cấy yếm khí) và Simmon,s citrate, để tủ ấm 37o
C/18-24 h đọc kết quả:
+ LDC: dung dịch từ màu tím chuyển sang màu vàng, lysine âm tính. + Simoncitrate: phần thạch nghiêng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển.
+ Ure: dung dịch có màu đỏ nhạt chuyển sang mầu hồng rất đậm, ure dương tính.
Tiến hành định typ theo bảng cấu trúc kháng nguyên của Kauffmann-White.
2.3.2. Phương pháp giám định các đặc tính sinh hoá
Kiểm tra đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch TSI, bằng cách ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy trích sâu một đường xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 370C trong 24 giờ sau đó xem kết quả: bề mặt ống nghiệm có màu hồng, đường cấy trích sâu có màu đen do sản
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
sinh H2S. Những ống có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella sẽ được dùng để kiểm tra các phản ứng sinh hoá.
2.3.2.1. Phản ứng chuyển hoá đường: môi trường pepton
+ Thành phần: H2O: 1000 ml; Pepton: 15 g; Andre: 10 ml.
+ Cách pha: trộn đều hỗn hợp trên, đun cho tan hết rồi cho vào mỗi ống 1 ống Ampul. Hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, để nguội. Dùng pipet vô trùng nhỏ vào mỗi ống 5-6 giọt đường (mỗi ống 1 loại đường). Kiểm tra vô trùng trong tủ ấm ở 370
C trong 24h. Sau đó nhỏ 5 - 6 giọt canh trùng để tủ ấm 370C trong 24 giờ.
+ Đọc kết quả.
- Nếu vi khuẩn lên men sinh hơi thì đẩy ống Ampul lên.
- Nếu vi khuẩn không lên men đường, môi trường không đổi màu. - Nếu vi khuẩn lên men đường, môi trường đổi màu sang màu đỏ.
2.3.2.2. Phản ứng Indole (dùng thuốc thử Kavac)
+ Phương pháp tiến hành: cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt để ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ, sau đó nhỏ từ từ vào thành ống nghiệm 4-5 giọt thuốc thử Kovac.
+ Đọc kết quả: Salmonella phản ứng sinh Indol âm tính nên bề mặt môi trường không có màu đỏ đậm.
2.3.2.3. Phản ứng sinh H2S
+ Phương pháp làm: dùng que cấy đầu nhọn vô trùng lấy vi khuẩn rồi cấy trích sâu vào môi trường TSI agar để tủ ấm 370C trong 24 giờ. Nếu vi khuẩn sinh H2S thì dọc theo đường cấy sẽ xuất hiện màu đen.
2.3.2.3. Phản ứng Catalase và Oxidase
Đây là 2 phản ứng thực hiện đơn giản và nhanh với khuẩn lạc thu được từ thạch đĩa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Phương pháp tiến hành thử như sau:
Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính. Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc. Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.
+ Phản ứng Oxidase:
Phản ứng này phụ thuộc vào sự có mặt của các men chứa sắt có trong vi khuẩn. Kết quả làm chuyển nhanh tác nhân của phản ứng từ không màu chuyển sang màu tím đậm trong vòng 10 giây. Nếu thời gian chuyển màu dài hơn, kết quả âm tính. Tác nhân của phản ứng có thể làm khô trên một miếng giấy lọc sạch và khuẩn lạc được nhặt ra và phiết lên. Màu tím xuất hiện sau vài giây thực hiện, phản ứng cho kết quả dương tính.
2.3.3. Xác định typ của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kháng huyết thanh đơn giá O, H của hãng SIFIN (Đức) và Bio RAD (Pháp).
Sử dụng khay thuỷ tinh trong đó có các giếng nhỏ. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh vào giếng, dùng que cấy vô trùng lấy 1 phần khuẩn lạc cần định typ từ thạch nuôi cấy, trộn đều khuẩn lạc và kháng huyết thanh, lắc nhẹ và quan sát:
+ Phản ứng dương tính: có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti. + Phản ứng âm tính: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục.
Đối với các chủng sau khi định được kháng nguyên O, H1 mà chưa định được typ ta phải định pha 2 của kháng nguyên H. Sau khi xác định kháng nguyên H pha 1 theo sơ đồ trên, tiến hành xác định pha 2 như sau:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, chỉ cần pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dùng đĩa có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đường kính 6cm. trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục đích ức chế pha 1.Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6).
- Sau khi đã có thạch Sven Gard, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở giữa đĩa thạch.
- Nuôi ở 37oC/24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như