3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.4. Kết quả giám định Salmonella phân lập từ vịt bằng kháng huyết
O đơn và đa giá
Trên cơ sở những đặc tính sinh vật, hoá học đặc trưng của 35 chủng
Salmonella phân lập được từ vịt đã được xác định. Để có kết luận chắc chắn hơn chúng tôi tiến hành giám định bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh Salmonella nhóm O đơn và đa giá. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Kết quả giám định vi khuẩn Salmonella từ vịt bằng kháng
huyết thanh O đơn và đa giá
STT Nhóm huyết thanh Số mẫu giám định Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ (%) 1 O đa giá 35 35 100 2 B 35 19 54,29 3 D1 35 6 17,14 4 E1 35 5 14,29 5 E2 35 2 5,7 6 E4 35 3 8,57
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy: 35 chủng vi khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn
Salmonella qua giám định các đặc tính sinh vật hoá học đã được khẳng định một cách chắc chắn hơn bằng phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O đa giá với tỷ lệ 100% dương tính.
Kết quả thử phản ứng với kháng huyết thanh O đơn giá thể hiện tỷ lệ nhiễm các chủng Salmonella trên vịt phân lập được thuộc nhóm B là cao nhất (19/35) chiếm 54,29%, sau đó là nhóm D1 chiếm tỷ lệ 17,14% (6/35), nhóm E1 chiếm tỷ lệ 14,29% (5/35), E4 chiếm tỷ lệ 8,57 (3/35) và nhóm có tỷ lệ thấp nhất là nhóm E2 chiếm tỷ lệ 5,7% (2/35). Như vậy Salmonella thuộc nhóm B, D1, E1 xuất hiện nhiều nhất trong tổng các chủng Salmnonella phân lập được từ vịt.
3.5. Kết quả định typ vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc từ vịt
Việc định typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh là một vấn đề quan trọng. Vì chỉ xác định được đúng các typ gây bệnh cho vật nuôi chúng ta mới có hướng đúng đắn để phòng và chống bệnh do chúng gây ra một cách hiệu quả nhất (Selbitz H-J. và cs, 1995) [71]. Từ những chủng Salmonella phân lập được bằng phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá Poly OH ở trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành định typ bằng kháng huyết thanh đơn giá O5, O9. Sau đó xác định kháng nguyên lông bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch (37oC/24h) và làm phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng pha 1. Tiến hành ức chế pha 1, nuôi cấy và làm ngưng kết để phát hiện pha 2, từ đó tìm ra các typ Salmonella chính gây bệnh cho vịt. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.7: Kết quả định typ vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc từ vịt
Kháng nguyên O Kháng nguyên H Kết quả định typ “H” pha 1 “H” pha 2 Nhóm Số mẫu Thành phần Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) Thành phần Số mẫu (+) Tỷ lệ (%) B 19 i 17 89,47 1,2 9 47,37 S. typhimurium f, g 2 10,53 1 2 10,53 S. derby D1 7 c 2 28,57 1, 5 1 14,29 S. dublin {f}, g, m, {p} 5 71,43 1, 7 2 28,57 S. enteritidis E1 5 c, h 2 40 1, 6 1 20 S. anatum E4 4 g, {s}, t 1 25 S. senftenberg
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy những chủng gây bệnh cho vịt thuộc nhóm B đại diện chính là S. typhimurium, S. derby; nhóm D1: S. enteritidis, S. dublin, nhóm E1 (S. anatum); nhóm E4 (S. senftenberg).
Quinn và cs (1994) [68]; Nagaraja (1991) [63], cho biết những serova chính đại diện cho các nhóm Salmonella phân lập từ vịt bao gồm:
- Nhóm B: S. typhimurium, S. sandiego, S. postdam, S. derby. - Nhóm D1: S. enteritidis, S. dublin.
- Nhóm E1: S. anatum, S. amsterdam. - Nhóm E2: S. newingston.
- Nhóm E4: S. taksony, S. senftenberg.
Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về các typ Salmonella chính gây bệnh trên vịt tại hai tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang có sự tương đồng với các tác giả trên.
Taunay và cs (1996) [72], cho biết: S. enteritidis và S. typhimurium
được biết đến trên thế giới là hai typ Salmonella gây bệnh chủ yếu trên gà thịt và trứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phân tích sự phân bố của các chủng Salmonella trên các mẫu phân lập được, đặc biệt với S. typhimurium là serovar được xác nhận là nguyên nhân quan trọng gây bệnh PTH ở gia cầm với tỷ lệ khá cao 47,37%. Ngoài ra, S. enteritidis cũng là nguyên nhân gây bệnh PTH vịt xuất hiện với tỷ lệ khá cao (28,57).
Bảng 3.8: Kết quả xác định S. typhimurium và S. enteritidis phân lập đƣợc
trên địa bàn nghiên cứu
STT Trại Số mẫu Salmonella Số mẫu có S. enteritidis Tỷ lệ % Số mẫu có S. typhimurium Tỷ lệ % QV1 (E) 4 0 0 1 25 QV2 (T) 8 1 12,5 2 25 TD (T) 6 0 0 2 33,33 YT (T) 3 0 0 1 33,33 VY (E) 7 1 14,29 0 0 TY (T) 7 0 0 3 42,86 Tổng 35 2 5,7 9 25,7
Kết quả định typ 35 chủng Salmonella phân lập được cho thấy S. enteritidis
xuất hiện với tỷ lệ 5,7% còn S. typhimurium xuất hiện với tỷ lệ 25,7%. Kết quả tìm thấy 2 chủng Salmonella trên chưa cao vì lý do tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay rất phổ biến.
Kết quả nghiên này tương đối phù hợp với nghiên cứu trước đây của Trần Xuân hạnh và cs (1998) [15], và nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Huân và cs (2006) [18], ngoài 3 chủng trên đây với tỷ lệ nhiễm cao, các tác giả còn phân lập được một số chủng khác nữa (S. sandiago; S. bispebjerg; S. posdam; S. norwich; S. irumu; S. sanuan; S. newland; S. alford; S. anatum; S. taksony) với tần xuất thấp (0,6-5,7%). Tuy nhiên chủng S. senftenberg trên vịt trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Huân và cs (2006) [18], lại xuất hiện với tỷ lệ cao nhất chiếm tỷ lệ 23,9% (38/159).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tsai HJ và Hsaing PH (2005) [75], tìm thấy 10 chủng Salmonella trên vịt là S. potsdam (31.9%), S. dusseldorf (18.7%), S. indiana (14.3%), S. typhimurium
(7.7%), S. hadar (5.5%), S. newport (4.4%), S. derby (4.4%), S. montevideo
(2.2%), S. schwarzengrund (2.2%), and S. asinnine (1.1%). Sự khác biệt giữa các chủng Salmonella tìm thấy trong các nghiên cứu có lẽ do điều kiện địa lý, khí hậu, điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng.
68.6%
25.7% 5.7%
S. enteritidis S. typhimurium Các chủng Salmonella khác
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ nhiễm S. enteritidis và S. typhimurium trên vịt
3.6. Kết quả xác định kháng nguyên bám dính của vi khuẩn Salmonella
phân lập đƣợc từ vịt
Để nghiên cứu khả năng gây bệnh của một số loài vi khuẩn, một trong những yếu tố được đánh giá có ý nghĩa quan trọng là khả năng bám dính vào tế bào của vật chủ, đây là bước quan trọng đầu tiên để thực hiện quá trình gây bệnh. Chúng tôi tiến hành xác định khả năng này qua phương pháp ngưng kết trực tiếp hồng cầu gà. Trong đó lấy kết quả dương tính khi ngưng kết ở hiệu giá có độ pha loãng cao nhất. Phương pháp nghiên cứu xác định khả năng ngưng kết của các chủng vi khuẩn Salmonella được thể hiện trên bảng 3.9.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.9: Kết quả phản ứng ngƣng kết trực tiếp hồng cầu của các
chủng vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc
Độ PL CK Số chủng VK Số mẫu ngƣng kết Mức độ ngƣng kết Đối chứng + ++ +++ ++++ Âm tính n % n % n % n % n % n % n % 1/2 11 9 81,82 4 36,36 2 18,18 2 18,18 1 9,09 2 18,18 0 0 1/4 11 9 81,82 4 36,36 2 18,18 2 18,18 1 9,09 2 18,18 0 0 1/8 11 8 72,73 3 27,27 2 18,18 2 18,18 1 9,09 3 27,27 0 0 1/16 11 6 54,55 2 18,08 2 18,18 1 9,09 1 9,09 5 45,45 0 0 1/32 11 3 27,27 2 18,18 1 9,09 0 0 0 0 8 72,73 0 0 1/64 11 2 18,18 1 9,09 1 9,09 0 0 0 0 9 81,82 0 0 1/128 11 1 9,09 1 9,09 0 0 0 0 0 0 10 90,91 0 0 1/256 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 29 100,0 0 0
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy: Trong 11 chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập được từ vịt, ở hiệu giá 1/2, số chủng có khả năng ngưng kết là 9/11 chiếm 81,82% số chủng Salmonella phân lập được. Mức ngưng kết chiếm số lượng cao nhất là 1 (+) với 4/11 chủng (36,36%), tiếp đó là các mức ngưng kết 2 (+) và 3 (+), số chủng ngưng kết ở mỗi mức là 2/11 với 18,18% số chủng phân lập được. Mức ngưng kết và tỷ lệ giảm thấp ở hiệu giá 1/32, tổng số chủng ngưng kết còn 3/11 (27,27%), trong đó tập trung chủ yếu ở mức 1 (+) là 2/11 (18,18%) và 2 (+) với 1/11 chủng (9,09%). Với hiệu giá 1/64, số chủng có khả năng ngưng kết giảm còn 2/11 chủng (18,18%), trong đó ở mức ngưng kết 1 (+) và ở mức 2 (+) còn 1 chủng (9,09%). Tới hiệu giá 1/128 chỉ còn 1 chủng, trong đó 1 chủng ngưng kết ở mức 1 (+) (9,09%). Khi nghiên cứu ở hiệu giá 1/256, không còn chủng ngưng kết ở hiệu giá này.
Jones và Richardson (1981) [57], những vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hoá, thì thường có khả năng bám dính cố định vào lớp niêm mạc của ruột bởi yếu tố bám dính (Fimbriae), sau khi đã bám dính, vi khuẩn xâm nhập vào các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lớp tế bào tổ chức bên trong. Với độc lực, độc tố gây bệnh, vi khuẩn phá huỷ riềm bàn chải của niêm mạc ruột, gây rối loạn quá trình trao đổi muối, nước cùng các chất điện giải làm nước từ ngoài tổ chức trong cơ thể bị hấp thu nhiều vào ruột gây ra tiêu chảy.
3.7. Khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn S. typhimurium và
S. enteritidis phân lập đƣợc từ vịt
Độc tố là một trong những yếu tố độc lực quan trọng giúp cho vi khuẩn có khả năng xâm nhập và phá huỷ các tổ chức tế bào của vật chủ. Để làm sáng tỏ hơn vai trò gây bệnh của các chủng vi khuẩn S. typhimurium và
S. enteritidis trên vịt, chúng tôi tiến hành xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của 11 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được từ vịt bằng phương pháp khuếch trên da thỏ. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella trên được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Xác định độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập đƣợc từ vịt Chủng VK Liều tiêm (ml) Tiêm (Nội bì - nb) Khả năng sản sinh độc tố ST LT ST + LT QV1 (E) 0,1 nb + - - QV2 (T) 0,1 nb - + - QV3 (T) 0,1 nb + - - TD1 (T) 0,1 nb + + + TD2 (T) 0,1 nb - + - YT (T) 0,1 nb + + + VY (E) 0,1 nb - + - TY1 (T) 0,1 nb + - - TY2 (T) 0,1 nb + + + TY3 (T) 0,1 nb + - - TY4 (T) 0,1 nb + + + Tổng 8/11 7/11 4/11 (%) 72,73 63,64 36,36 Chú thích: Độc tố chịu nhiệt: ST
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Qua kết quả bảng 3.10 ta thấy: hầu hết các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập được đều có khả năng sản sinh độc tố. Trong đó số chủng sản sinh độc tố chịu nhiệt là 7/11 chủng (72,73%), số chủng sản sinh độc tố không chịu nhiệt là 7/11 với 63,64%. Số chủng sản sinh cả 2 loại độc tố là 4/11 (36,36%).
Kết quả nghiên cứu khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được của chúng tôi phù hợp với kết quả của Nguyễn Quang Tuyên (1996) [45], về khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella phân lập từ bê, nghé tại một số tỉnh Phía Bắc và các vùng phụ cận ngoại thành Hà Nội, theo nghiên cứu của các tác giả thì tỷ lệ xác định được ST của vi khuẩn Salmonella là 27/35 (77,14%), LT là 24/35 (68,57%). Số chủng sản sinh cả 2 loại độc tố là 20/35 chủng (57,14%).
Cù Hữu Phú và cs (2000) [30], phân lập được từ gia súc tiêu chảy tại một số tỉnh miền Bắc Việt nam, số chủng Salmonella có khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt là 100% số chủng phân lập được.
Với kết quả nghiên cứu của Trần Thị Hạnh và cs (2002) [12], nghiên cứu khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập từ thực phẩm có nguồn gốc động vật cho thấy: với 16 chủng Salmonella phân lập được, số chủng sản sinh ST là 14/16 (87,50%), LT là 16/16 (100%) và số chủng sản sinh cả 2 loại độc tố trên là 14/16 (87,50%) số chủng phân lập được.
3.8. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đƣợc trên vịt
Selbitz và cs (1995) [71], cho biết: vi khuẩn Salmonella có rất nhiều typ, độc lực của mỗi lại phụ thuộc vào yếu tố gây bệnh. Ở mỗi typ, các yếu tố gây bệnh quyết định thể bệnh cấp tính hay mãn tính. Ngoài khả năng gây bệnh ở vịt, chúng còn có khả năng gây bệnh ở nhiều loài động vật cảm nhiễm máu nóng, máu lạnh khác. Song vai trò gây bệnh của một số chủng nào đó chỉ được công nhận sau khi tiến hành thử độc lực.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng BHI ở 37oC, sau 24 h tiêm cho chuột nhắt trắng với liều 0,2 ml/con vào xoang bụng. Mỗi chủng thử trên 5 chuột. Sau khi tiêm tiến hành theo dõi chuột trong vòng 72 h, chuột chết tiến hành phân lập lại vi khuẩn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả thử độc lực các chủng Salmonella phân lập đƣợc từ vịt Chủng vi khuẩn Liều tiêm (ml) Tiêm xoang bụng Số chuột tiêm Số chuột chết sau thời gian tiêm (giờ)
Tổng số chết (7 ngày) Phân lập lại VK 1-8 9-24 n Tỷ lệ (%) QV1 (E) 0,2 xb 5 2 3 5 100 + QV2 (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + TD (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + YT (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + VY (E) 0,2 xb 5 3 2 5 100 + TY (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + Đ/c (BHI) 0,2 xb 5 0 0 0 0 0 T.chung (n=6) 0,2 px 30 25/30 5/30 30/30 100
Qua kết quả xác định độc lực của các chủng Salmonella trên chuột thí nghiệm ở bảng 3.11 cho thấy: hai chủng S. typhimurium và S. enteritidis đều có độc lực mạnh làm chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 12 giờ sau khi tiêm. Trong đó chủng S. typhimurium có độc lực rất mạnh và mạnh hơn chủng
S.enterititdis, chủng này gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 5 giờ sau khi tiêm còn chủng S. enteritidis thì gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong vòng 12 giờ sau khi tiêm.
Sau khi chuột chết tiến hành mổ khám, kiểm tra bệnh tích của chuột thấy có biểu hiện chung là: viêm ruột, niêm mạc ruột xung huyết, xoang bụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chướng hơi, thuỷ thũng, gan, thận sưng, tụ máu. Phân lập lại vi khuẩn từ chuột chết, 100% các trường hợp đều thấy sự có mặt của vi khuẩn
Salmonella. Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Trần Thị Hạnh và cs (2003) [13], và kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997) [21].
Kết quả thử độc lực các chủng Salmonella phân lập được trên gà của Trần Thị Hạnh và cs (2003) [13], cho biết: trong vòng 24 giờ sau khi tiêm, tất cả các chuột thí nghiệm đều bị chết, trong đó 2 chủng S. enteritidis phân lập từ gà làm chuột chết sau 8 giờ tiêm.
Nghiên cứu của Nguyễn Quang Tuyên (1996) [45], độc lực của các chủng Salmonella phân lập được từ bê, nghé tiêu chảy gây chết chuột từ 33,33% tới 66,66%, thời gian gây chết chuột trung bình từ 24-48 giờ sau tiêm.
Cù Hữu Phú và cs (2000) [30], xác định độc lực của các chủng
Salmonella phân lập từ gia súc tiêu chảy, kết quả cho thấy: trong 10 chủng vi khuẩn Salmonella thử, có 6 chủng gây chết 100% số chuột tiêm, 2 chủng gây chết 50% số chuột được tiêm và 2 chủng không gây chết chuột. Tính chung các chủng gây chết 70% chuột thí nghiệm, thời gian gây chết trung bình là 30 - 48 giờ sau tiêm.
Từ kết quả thử độc lực 2 chủng S. enteritidis và S. typhimurium trong nghiên cứu của chúng tôi so sánh với các nghiên cứu của một số tác giả khác về kết quả thử độc lực các chủng Salmonella phân lập được từ gia súc, gia cầm trên chuột cho thấy thời gian và số chuột chết trong các nghiên cứu có sự chênh lệch nhau. Có thể giải thích sự chênh lệch đó như sau:
- Các chủng Salmonella được phân lập từ các đối tượng vật chủ khác nhau, trên các địa bàn nghiên cứu khác nhau và được phân lập theo các qui trình khác nhau.
- Một số nghiên cứu sau khi phân lập được vi khuẩn Salmonella đã bảo