3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.7. Khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn S.typhimurium
S. enteritidis phân lập đƣợc từ vịt
Độc tố là một trong những yếu tố độc lực quan trọng giúp cho vi khuẩn có khả năng xâm nhập và phá huỷ các tổ chức tế bào của vật chủ. Để làm sáng tỏ hơn vai trò gây bệnh của các chủng vi khuẩn S. typhimurium và
S. enteritidis trên vịt, chúng tôi tiến hành xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của 11 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được từ vịt bằng phương pháp khuếch trên da thỏ. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella trên được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Xác định độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập đƣợc từ vịt Chủng VK Liều tiêm (ml) Tiêm (Nội bì - nb) Khả năng sản sinh độc tố ST LT ST + LT QV1 (E) 0,1 nb + - - QV2 (T) 0,1 nb - + - QV3 (T) 0,1 nb + - - TD1 (T) 0,1 nb + + + TD2 (T) 0,1 nb - + - YT (T) 0,1 nb + + + VY (E) 0,1 nb - + - TY1 (T) 0,1 nb + - - TY2 (T) 0,1 nb + + + TY3 (T) 0,1 nb + - - TY4 (T) 0,1 nb + + + Tổng 8/11 7/11 4/11 (%) 72,73 63,64 36,36 Chú thích: Độc tố chịu nhiệt: ST
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Qua kết quả bảng 3.10 ta thấy: hầu hết các chủng vi khuẩn Salmonella
phân lập được đều có khả năng sản sinh độc tố. Trong đó số chủng sản sinh độc tố chịu nhiệt là 7/11 chủng (72,73%), số chủng sản sinh độc tố không chịu nhiệt là 7/11 với 63,64%. Số chủng sản sinh cả 2 loại độc tố là 4/11 (36,36%).
Kết quả nghiên cứu khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được của chúng tôi phù hợp với kết quả của Nguyễn Quang Tuyên (1996) [45], về khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella phân lập từ bê, nghé tại một số tỉnh Phía Bắc và các vùng phụ cận ngoại thành Hà Nội, theo nghiên cứu của các tác giả thì tỷ lệ xác định được ST của vi khuẩn Salmonella là 27/35 (77,14%), LT là 24/35 (68,57%). Số chủng sản sinh cả 2 loại độc tố là 20/35 chủng (57,14%).
Cù Hữu Phú và cs (2000) [30], phân lập được từ gia súc tiêu chảy tại một số tỉnh miền Bắc Việt nam, số chủng Salmonella có khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt là 100% số chủng phân lập được.
Với kết quả nghiên cứu của Trần Thị Hạnh và cs (2002) [12], nghiên cứu khả năng sản sinh độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập từ thực phẩm có nguồn gốc động vật cho thấy: với 16 chủng Salmonella phân lập được, số chủng sản sinh ST là 14/16 (87,50%), LT là 16/16 (100%) và số chủng sản sinh cả 2 loại độc tố trên là 14/16 (87,50%) số chủng phân lập được.
3.8. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đƣợc trên vịt
Selbitz và cs (1995) [71], cho biết: vi khuẩn Salmonella có rất nhiều typ, độc lực của mỗi lại phụ thuộc vào yếu tố gây bệnh. Ở mỗi typ, các yếu tố gây bệnh quyết định thể bệnh cấp tính hay mãn tính. Ngoài khả năng gây bệnh ở vịt, chúng còn có khả năng gây bệnh ở nhiều loài động vật cảm nhiễm máu nóng, máu lạnh khác. Song vai trò gây bệnh của một số chủng nào đó chỉ được công nhận sau khi tiến hành thử độc lực.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng BHI ở 37oC, sau 24 h tiêm cho chuột nhắt trắng với liều 0,2 ml/con vào xoang bụng. Mỗi chủng thử trên 5 chuột. Sau khi tiêm tiến hành theo dõi chuột trong vòng 72 h, chuột chết tiến hành phân lập lại vi khuẩn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả thử độc lực các chủng Salmonella phân lập đƣợc từ vịt Chủng vi khuẩn Liều tiêm (ml) Tiêm xoang bụng Số chuột tiêm Số chuột chết sau thời gian tiêm (giờ)
Tổng số chết (7 ngày) Phân lập lại VK 1-8 9-24 n Tỷ lệ (%) QV1 (E) 0,2 xb 5 2 3 5 100 + QV2 (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + TD (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + YT (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + VY (E) 0,2 xb 5 3 2 5 100 + TY (T) 0,2 xb 5 5 0 5 100 + Đ/c (BHI) 0,2 xb 5 0 0 0 0 0 T.chung (n=6) 0,2 px 30 25/30 5/30 30/30 100
Qua kết quả xác định độc lực của các chủng Salmonella trên chuột thí nghiệm ở bảng 3.11 cho thấy: hai chủng S. typhimurium và S. enteritidis đều có độc lực mạnh làm chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 12 giờ sau khi tiêm. Trong đó chủng S. typhimurium có độc lực rất mạnh và mạnh hơn chủng
S.enterititdis, chủng này gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 5 giờ sau khi tiêm còn chủng S. enteritidis thì gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong vòng 12 giờ sau khi tiêm.
Sau khi chuột chết tiến hành mổ khám, kiểm tra bệnh tích của chuột thấy có biểu hiện chung là: viêm ruột, niêm mạc ruột xung huyết, xoang bụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chướng hơi, thuỷ thũng, gan, thận sưng, tụ máu. Phân lập lại vi khuẩn từ chuột chết, 100% các trường hợp đều thấy sự có mặt của vi khuẩn
Salmonella. Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Trần Thị Hạnh và cs (2003) [13], và kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997) [21].
Kết quả thử độc lực các chủng Salmonella phân lập được trên gà của Trần Thị Hạnh và cs (2003) [13], cho biết: trong vòng 24 giờ sau khi tiêm, tất cả các chuột thí nghiệm đều bị chết, trong đó 2 chủng S. enteritidis phân lập từ gà làm chuột chết sau 8 giờ tiêm.
Nghiên cứu của Nguyễn Quang Tuyên (1996) [45], độc lực của các chủng Salmonella phân lập được từ bê, nghé tiêu chảy gây chết chuột từ 33,33% tới 66,66%, thời gian gây chết chuột trung bình từ 24-48 giờ sau tiêm.
Cù Hữu Phú và cs (2000) [30], xác định độc lực của các chủng
Salmonella phân lập từ gia súc tiêu chảy, kết quả cho thấy: trong 10 chủng vi khuẩn Salmonella thử, có 6 chủng gây chết 100% số chuột tiêm, 2 chủng gây chết 50% số chuột được tiêm và 2 chủng không gây chết chuột. Tính chung các chủng gây chết 70% chuột thí nghiệm, thời gian gây chết trung bình là 30 - 48 giờ sau tiêm.
Từ kết quả thử độc lực 2 chủng S. enteritidis và S. typhimurium trong nghiên cứu của chúng tôi so sánh với các nghiên cứu của một số tác giả khác về kết quả thử độc lực các chủng Salmonella phân lập được từ gia súc, gia cầm trên chuột cho thấy thời gian và số chuột chết trong các nghiên cứu có sự chênh lệch nhau. Có thể giải thích sự chênh lệch đó như sau:
- Các chủng Salmonella được phân lập từ các đối tượng vật chủ khác nhau, trên các địa bàn nghiên cứu khác nhau và được phân lập theo các qui trình khác nhau.
- Một số nghiên cứu sau khi phân lập được vi khuẩn Salmonella đã bảo quản các chủng này trong thời gian dài nên trong quá trình cấy chuyển nhiều lần đã làm giảm độc lực của các chủng này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Bản thân một số chủng Salmonella không có khả năng gây bệnh mà chỉ cư trú ở đường tiêu hoá của vật nuôi, hoặc độc lực của chúng thấp.
3.9. Kết quả xác định LD50 của vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc từ vịt
Sau khi kiểm tra độc lực, và khả năng gây bệnh của các chủng
Salmonella phân lập được, chúng tôi sử dụng 2 chủng QV2 (S. typhimurium) và VY (S. enteritidis) để thử LD50 (xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) vì hai chủng này là hai đại diện cho hai chủng chính gây bệnh PTH trên vịt và có độc lực mạnh nhất trong số những chủng thử độc lực trên chuột nhắt trắng và cả hai chủng này đều có thời gian gây chết vịt thực nghiệm nhanh nhất. Để thử LD50, vi khuẩn được pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 10-1
, 10-2... 10-9, mỗi nồng độ của mỗi chủng tiêm cho 5 chuột, mỗi chuột tiêm 0,2 ml canh trùng theo đường dưới da, theo dõi chuột chết trong vòng 7 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12 và bảng 3.13.
Bảng 3.12: Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm gây nhiễm bởi chủng
S. enteritidis phân lập đƣợc từ vịt Độ pha loãng canh trùng Số chuột tiêm (con) Số sống chết thực tế Số tích luỹ Tỷ lệ chết (%) Sống (con) Chết (con) Tổng số sống (con) Tổng số chết (con) 10-3 5 0 5 0 21 100 10-4 5 0 5 0 16 100 10-5 5 1 4 1 11 91,67 10-6 5 2 3 3 7 70 10-7 5 2 3 5 4 44,44 10-8 5 4 1 9 1 10 10-9 5 5 0 14 0 0
Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy: ở các độ pha loãng khác nhau từ 10-3
đến 10-9 tỷ lệ chuột chết không giống nhau ở các thời điểm khác nhau. Ở độ pha
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
loãng 10-3 đã giết chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 12 - 24 giờ. Ở độ pha loãng 10-4 giết chết 100% chuột thí nghiệm sau 18 - 30 giờ. Tăng độ pha loãng lên 10-5 có 4/5 chuột chết sau khi tiêm 28 - 36 giờ. Đến độ pha loãng 10-6 sau khi tiêm 36 - 48 giờ gây chết 3/5 con. Tăng độ pha loãng lên 10-7 sau khi tiêm 72 giờ gây chết 3/2 chuột thí nghiệm. Ở nồng độ 10-8
sau khi tiêm 84 giờ gây chết 1/5 chuột thí nghiệm. Khi pha loãng canh trùng đến 10-9
sau khi tiêm theo dõi chuột sau 7 ngày cả 5 chuột tiêm đều bình thường, không có biểu hiện triệu chứng gì về bệnh. Vậy số lượng vi khuẩn có mặt trong canh trùng ở độ pha loãng 10-9
không đủ để giết chết chuột.
Tính LD50 theo công thức của Reed - Muench theo mục phương pháp xử lý số liệu (mục 2.4, tr: 56).
Theo bảng số liệu 3.12 ta có: A = 10-6
; a = 70; b = 44,44; d = -1. Thay vào công thức ta có:
LgLD50 = Lg10-6 + 70 - 50 x (-1) 70 - 44,44 → LgLD50 = Lg10-6,78 ↔ LD50 = 10-6,78
Để tính đại lượng tuyệt đối của độ pha loãng tương ứng với LD50, xem
bảng đối logarit ta tìm được LD50 = 10-6,78 của chủng vi khuẩn S. enteritidis
tương ứng với độ pha loãng là 1: 6025595,861 của hỗn dịch vi khuẩn. Vậy liều LD50 của chủng S. enteritidis phân lập từ vịt với 0,2 ml canh trùng ở độ
pha loãng 10-6,78 tương ứng với 1205119 vi khuẩn. Liều này hết sức nhỏ, nếu vi khuẩn có độc lực cao được tiêm cho động vật cảm nhiễm bằng con đường cảm thụ nhất thì vi khuẩn rất dễ dàng và nhanh chóng gây bệnh cho động vật được tiêm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.13: Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm gây nhiễm chủng
S. typhimurium phân lập đƣợc từ vịt Độ pha loãng canh trùng Số chuột tiêm (con) Số sống chết thƣc tế Số tích luỹ Tỷ lệ chết (%) Sống (con) Chết (con) Tổng số sống (con) Tổng số chết (con) 10-3 5 0 5 0 18 100 10-4 5 1 4 1 13 92,86 10-5 5 1 4 2 9 81,82 10-6 5 2 3 4 5 55,55 10-7 5 4 1 8 2 20 10-8 5 4 1 12 1 7,69 10-9 5 5 0 17 0 0
Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy: ở các độ pha loãng khác nhau từ 10-3
đến 10-9 tỷ lệ chuột chết không giống nhau ở các thời điểm khác nhau. Ở độ pha loãng 10-3 đã giết chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 12-24 giờ. Ở độ pha loãng 10-4 giết chết 4/5 chuột thí nghiệm sau 18-24 giờ. Tăng độ pha loãng lên 10-5 có 4/5 chuột chết sau khi tiêm 24 - 32 giờ. Đến độ pha loãng 10-6 sau khi tiêm 32 - 48 giờ gây chết 3/5 con. Tăng độ pha loãng lên 10-7 sau khi tiêm 66 giờ gây chết 1/5 chuột thí nghiệm. Ở nồng độ 10-8
sau khi tiêm 78 giờ gây chết 1/5 chuột thí nghiệm. Khi pha loãng canh trùng đến 10-9
sau khi tiêm theo dõi chuột sau 7 ngày cả 5 chuột tiêm đều bình thường, không có biểu hiện triệu chứng gì về bệnh. Vậy số lượng vi khuẩn có mặt trong canh trùng ở độ pha loãng 10-9
không đủ để giết chết chuột.
Tính LD50 theo công thức của Reed - Muench theo mục phương pháp xử lý số liệu (mục 2.4, tr: 56).
Theo bảng số liệu 3.13 ta có: A = 10-6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thay vào công thức ta có: LgLD50 = Lg10-6 + 55,55 - 50 x (-1) 55,55 - 20 → LgLD50 = Lg10-6,16 ↔ LD50 = 10-6,16
Bằng cách xem bảng đối logarit tương tự như đối với cách tìm LD50 của chủng S. enteritidis ta tìm được LD50 = 10-6,16 của chủng vi khuẩn
S. typhimurium tương ứng với độ pha loãng là 1: 1445439,771 của hỗn dịch vi
khuẩn. Vậy liều LD50 của chủng S. typhimurium phân lập từ vịt với 0,2 ml canh trùng ở độ pha loãng 10-6,16
tương ứng với 289087 vi khuẩn. Liều này rất nhỏ và còn nhỏ hơn LD50 của chủng vi khuẩn S. enteritidis.
So sánh liều LD50 của 2 chủng S.enteritidis và S. typhimurium ta thấy trong 0,2 ml canh trùng của chủng S. typhimurium có 289087 vi khuẩn còn trong 0,2 ml canh trùng chủng S. enteritidis có 1205119 vi khuẩn. Qua đó, có thể kết luận độc lực của chủng S. typhimurium cao hơn độc lực chủng S. enteritidis. Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn trong 0,2ml canh trùng của cả hai chủng này cũng rất nhỏ nên có thể kết luận độc lực của 2 chủng này là rất mạnh.
Như vậy kết quả xác định LD50của các chủng vi khuẩn Salmonella của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Quang Tuyên (1996) [45], xác định được LD50 của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập từ bê, nghé tiêu chảy từ 1,5 x 106
của S. enteritidis 2,43 x 106 với S. dublin; 3,9 x 106 đối với
S. typhimurium và 3,5 x 106 với các chủng Salmonella khác.
3.10. Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên bản động vật của vi khuẩn
Salmonella phân lập từ vịt
Sau khi đã thử độc lực trên chuột các chủng S. typhimurium và S. enteritidis
phân lập được từ vịt. Chúng tôi tiến hành chọn 6 chủng Salmonella đã thử độc lực để nuôi cấy trong môi trường BHI ở 37oC trong 24 giờ. Sử dụng canh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trùng nguyên gây bệnh cho vịt bằng đường tiêm dưới da và tiêm xoang bụng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14: Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên vịt bằng một số chủng
Salmonella phân lập đƣợc từ vịt Chủng gây bệnh Đƣờng tiêm Số vịt tiêm (con) Số vịt chết (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian gây chết (giờ) QV1 (E) Dưới da 2 2 100 54 Xoang bụng 2 1 50 72 QV2 (T) Dưới da 2 2 100 24 Xoang bụng 2 2 100 24 TD (T) Dưới da 2 2 100 24 Xoang bụng 2 2 100 36 YT (T) Dưới da 2 2 100 48 Xoang bụng 2 2 100 48 VY (E) Dưới da 2 2 100 54 Xoang bụng 2 1 50 48 TY (T) Dưới da 2 2 100 36 Xoang bụng 2 2 100 48 Tổng 24 22 91,67 24-72
Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy tất cả 6 chủng Salmonella phân lập được đem gây nhiễm đều có khả năng gây bệnh cho vịt con 10 ngày tuổi. Bằng đường tiêm dưới da với liều 0,2 ml canh trùng/vịt gây chết 100% số vịt thử nghiệm được tiêm, thời gian gây chết vịt sớm nhất là 24 giờ và muộn nhất là 72 giờ. Bằng đường tiêm xoang bụng gây chết 10/12 số vịt thí nghiệm chiếm tỷ lệ 83,33%. Sự khác nhau này có thể giải thích là do đường gây nhiễm bệnh khác nhau và khả năng mẫn cảm của mầm bệnh với cơ thể vật chủ là khác nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có sự tương đồng với kết quả nghiên