II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.3. Phương pháp
Kế thừa công nghệ tạo giọt bằng dòng chảy sử dụng trong công nghệ đóng gói protein, hợp chất hữu cơ và thuốc [44], [4], tác giả Varun T. và cs (2009) đã nghiên cứu tạo ra các vi hạt chứa tế bào bằng phương pháp này [144].
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng hai dòng chảy, một dòng mang hỗn hợp Alginate và tế bào, một dòng khác mang chất tạo liên kết ion (ví dụ Barium). Các giọt được hình thành nhờ lực đẩy và sức căng bề mặt khi dòng Alginate và tế bào gặp hai dòng dầu. Các giọt, sau đó, gặp dòng cation tại vùng có
hình “chữ Y”, xảy ra phản ứng liên kết tạo gel và hình thành nên các vi hạt hoàn chỉnh.
Hình 1.7: Phương pháp đóng gói bằng dòng chảy
Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là sự hình thành liên kết diễn ra nhanh tại vùng “chữ Y” hình thành nên dạng gel trước khi hỗn hợp tạo thành hình khối cầu. Do đó, các vỏ của các vi hạt có độ dày không đồng đều.
1.3.3. Ứng dụng điều trị Bệnh tiểu đường tuýp 1 bằng cấy ghép tế bào tiết insulin được cô lập miễn dịch insulin được cô lập miễn dịch
1.3.3.1. Lịch sử ứng dụng
Đóng gói tế bào ngày nay được sử dụng rộng rãi nhờ vào các ưu điểm như: cấu trúc hình học giúp các vi hạt có tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích cao hơn; có khả năng kháng cao đối với stress hóa học; khoảng cách khuếch tán giữa các đảo tụy và bề mặt tương đối ngắn; tốc độ đáp ứng nhanh và có thể được dùng trên nhiều vị trí cấy ghép [20]. Tiến trình nhằm cô lập miễn dịch bằng việc đóng gói còn có ưu điểm đặc biệt hơn nữa là tế bào trong hạt vẫn có thể tăng sinh trong một khoảng thời gian. Các tiểu đảo bị apoptosis hoặc bị hoại tử (necrosis) phân tách và được loại bỏ trong quá trình nuôi cấy in vitro, vì vậy số lượng tế bào chết trong mẫu hoàn toàn được kiểm soát. Các tiểu đảo tụy được đóng gói và có thể được giữ trong điều kiện in vitro, do đó chúng ta có thể kiểm soát được tỉ lệ tế bào sống, giảm một cách đáng kể
sự giải phóng các mảnh vỡ tế bào (đồng loài hoặc dị loài) - nguyên nhân chính gây ra sự đáp ứng miễn dịch [117].
Phương pháp đóng gói sử dụng cho tế bào và mô đã được mô tả từ những năm 1980. Công nghệ đóng gói còn được gọi là cô lập miễn dịch vì khả năng giảm
tối thiểu tác động của tế bào ngoại lai lên hệ miễn dịch của vật chủ đồng thời trách các đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ. Phương pháp đóng gói cho phép đóng gói tiểu đảo tụy, các tế bào β phân lập từ tuyến tụy và các tế bào tiết insulin thu nhận từ in vivo hay in vitro.
Ứng dụng đóng gói cho cấy ghép tiểu đảo người đã được ứng dụng thành công [12]. Đồng thời, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng khả quan khi cấy ghép các “tiểu đảo nhân tạo” còn có tác dụng khi cấy ghép dị loài, tức là dùng nguồn tế bào khác loài [40]. Với những đặc điểm ưu việt đó, Viện Sức khỏe Italy (Italian Institute of Health) với sự cho phép của Ủy ban thuốc Châu Âu (European Drug Agency_EMEA) và Ban quản lý lương thực và thuốc của Mỹ (The US Food and Drug Administration_FDA) đã ứng dụng công nghệ đóng gói trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 1 trên người.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đóng gói đã được tiến hành bởi tác giả Phan Kim Ngọc và cs (2011) và thu được những kết quả khả quan. Các TBG được sử dụng cảm ứng thành các tế bào tiết insulin, đóng gói và ghép trên các mô hình chuột cao đường huyết cho thấy có tác dụng điều hòa nồng độ đường huyết.
1.3.3.2. Các phương pháp cấy ghép
Các vi hạt được cấy ghép bằng nhiều phương pháp như cấy ghép ở các vị trí khác nhau hoặc cấy ghép cùng với một số thiết bị hỗ trợ. Các nỗ lực hiện nay nhằm tìm ra một phương pháp cấy ghép phù hợp sao cho tạo ra được một vi môi trường xung quanh các vi hạt, tăng tỷ lệ sống của tế bào trong vi hạt, bảo vệ chúng trước sự tấn công của hệ miễn dịch.
Cấy ghép vào mạch máu, phương pháp này đòi hỏi các vi hạt phải có kích thước nhỏ, có thể được cấy vào các tĩnh mạch. Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là tính xâm lấn cao, nguy cơ gây ra sự đông máu cục bộ, hạt có kích thước lớn có thể gây tử vong cho cơ thể ghép [25].
Cấy ghép ngoài mạch máu, có thể sử dụng cho tất cả các kích thước (microcapsule, macrocapsule và các thiết bị chứa được sử dụng kèm theo). Các hạt có kích thước lớn (macrocapsule) cho phép chứa được các tiểu đảo, giảm sự bám dính tế bào [145]. Theo nghiên cứu Muthyala và cs. (2011) cũng cho thấy các hạt macrocapsule làm từ poly(urethane)-poly(vinyl pyrrolidone) có thể duy trì chức năng trong thời gian dài (90 ngày) khi được cấy ghép.
Cấy ghép trong các dụng cụ chứa chuyên biệt (container) được phát triển bởi Gimi và cs (2009), Đại học Taxas tại Dallas. Các container là các khối có kích thước 300 μm làm từ polymer SU-8, các lỗ màng có kích thước 25 nm. Các container này được sử dụng để chứa các vi hạt và được cấy ghép vào cơ thể nhận. Phương pháp này hiện nay vẫn chưa được phát triển và nghiên cứu rộng rãi, tuy nhiên được đánh giá là có nhiều tiềm năng [38].
1.3.3.3. Phương pháp đánh giá tế bào trong vi hạt
Các vật liệu được sử dụng cho kỹ thuật đóng gói cần đảm bảo các yêu cầu sinh hóa. Tế bào trong vi hạt hấp thụ được chất dinh dưỡng, đồng thời cho phép các chất thải cũng như những sản phẩm tiết từ tế bào ra ngoài môi trường xung quanh.
Các tế bào trong vi hạt được đánh giá về tỷ lệ sống sót bằng các phương pháp như nhuộm và quan sát bằng kính hiển vi điện tử có độ phóng đại lớn; kiểm tra quá trình apoptosis và necrosis của tế bào (ví dụ Fluorimetric qualitative fluores- cein diacetate _ FDA của Sigma Aldrich); đánh giá hoạt động chức năng chuyển hóa của tế bào (ví dụ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide _ MTT của Qiagen). Ngoài ra, đối với các tế bào có chức năng tiết (ví dụ các tế bào tiết insulin) có thể đánh thông qua các phương pháp kiểm tra sự hiện diện của chất tiết trong môi trường nuôi cấy (in vitro) hoặc đánh giá tác động trên in vivo.
II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.1. Hóa chất-dụng cụ 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguồn tế bào gốc trung mô phân lập từ tủy xương người (mesenchymal stem cell derived from bone marrow-MSC-BM) được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Tế bào gốc. Tế bào được bảo quản trong Nitrogen -196oC.
Chuột sử dụng để làm mô hình cao đường huyết được mua từ Viện Pasteur, Thành phố Hồ Chí Minh và nuôi tại Phòng thí nghiệm Tế bào gốc.
2.1.2. Dụng cụ
Bảng 2.1: Các dụng cụ sử dụng trong quá trình thí nghiệm
STT Tên dụng cụ Hãng sản
xuất Nước sản xuất
1 Bình Roux 25 cm2, 75 cm2 Nunc Đan Mạch
2 Micropipette 100-1000 µl, 10-100 µl Eppendorf Đức 3 Eppendorf 100 µl, 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml Kartell Pháp
4 Kim tiêm insulin B.Braun Đức
5 Đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng, 24 giếng Nunc Đan Mạch 6 Màng lọc vô trùng 0,2 µm, 0,45 µm Minisart Hoa kỳ
7 Ống ly tâm 15 ml, 50 ml Corning Hoa Kỳ
8 Đầu típ 1 ml, 0,1 ml, 10 µl; típ đóng gói tế bào
9 Các dụng cụ khác: Duran, becher, erlen, kéo, kẹp, cá từ….
Típ đóng gói tế bào Kim tiêm insulin
2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2: Các thiết bị đặc trưng được sử dụng trong quá trình thí nghiệm
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược Olympus Nhật Bản 2 Tủ nuôi cấy lắc (Orbital incubator) Stuart-BioCare Anh
3 Máy Realtime PCR Eppendorf Đức
4 Máy FACS Calibur BD Bioscience Mỹ
5 Máy DTX 880 Beckman Coulter Mỹ
6 Máy ViCell Analysis BD Bioscience Mỹ
2.1.4. Hóa chất và môi trường 2.1.4.1. Hóa chất 2.1.4.1. Hóa chất
Thuốc nhuộm Oil Red: 0,1 g Oil Red (Sigma) pha trong 20 ml Isopropanol
(Merck), khuấy đều trong 10 phút ở 37oC, lọc bằng giấy lọc Whatman.
Thuốc nhuộm Dithizol (DTZ): 10 mg Dithizol (Merck) pha trong 10 ml
DMSO, lọc bằng giấy lọc Whatman, sử dụng trong vòng 24 giờ
Hóa chất tách RNA tổng số (Kit easy-BLUE) (Intron)
Hóa chất Realtime PCR: (Kit SYBR Green Quantitative RT-PCR)
(Stratagene)
Hóa chất Flow cytometry: Sheath Fluid; FACSflow; Kháng thể: CD166,
CD90, CD44, CD13, CD34, CD14, CD45, HLA-DR (BD Bioscience, San Jose, CA).
2.1.4.2. Môi trường
Môi trường DMEM/F12 15% FBS
Môi trường DMEM/F12 bổ sung 15% FBS được sử dụng để nuôi tế bào MSC-BM. Bột DMEM/F12 (Sigma) 3,9 g
L- glutamine 2,5 ml
HEPES 5 ml
NaHCO3 7,5 % 3,75 ml
Phenol red 0,5 ml
Môi trường dạng bột được pha trong nước cất, khuấy cho đến khi bột tan hoàn toàn, chuẩn pH môi trường đến 7,2 và định mức thể tích đến 1l, lọc qua màng lọc minipore 0,22 m và trữ ở -4oC.
Môi trường đánh giá khả năng biệt hóa của MSC
DMEM low glucose được bổ sung FBS 10%; Kháng sinh 1%; Dexamethasone 0,5 µM; 3-Isobutyl-1-methylxanthin-IBMX 0,5 µM; Indomethacin 50 µM; Ascorbic acid 50 µg.
Bảo quản 40C, sử dụng trong 1 tuần
Môi trường biệt hóa MSC thành tế bào tiết insulin
H-DMEM/F12 được bổ sung; Nicotinamide 10 nM; β-Mecaptoethanol 1mM; Transferrin 50 µg/ml; Retionic acid 0,1 nM; FBS 15%; Kháng sinh 1%. Trong đó, Retionic acid được pha trong DMSO ở nồng độ 1000X
Bảo quản 4oC, sử dụng trong 4 tuần.
Môi trường nuôi vi hạt trong điều kiện in vitro
Vi hạt có chứa tế bào được nuôi trong điều kiện in vitro trong môi trường có nồng độ đường cao (DMEM High-glucose) (Nồng độ glucose 25mM) bổ sung 15% FBS và 1% kháng sinh.
MSC-BM
Kiểm tra in vitro
Vi hạt có tế bào tiết insulin
Tế bào tiết insulin Nồng độ Alginate thích hợp Đánh giá khả năng thẩm thấu của vi hạt Alginate Đánh giá sự biểu hiện mRNA Đánh giá sự hiện diện insulin Tế bào tiết insulin
Đánh giá độ bền với
tác nhân Chelator
Kiểm tra in vivo
Kiểm tra hoạt động chuyển hóa của tế bào trong vi hạt thu
nhận từ chuột sau 15 ngày Kiểm tra hoạt
động chuyển hóa của tế bào trong vi hạt sau 5, 10 và 15 ngày
1% 1,5% 2%
- Kiểm tra khả năng biệt hóa - Kiểm tra marker
- Cảm ứng biệt hóa bằng hóa chất
Ghép vào chuột bị cao đường huyết
Kích thước của vi hạt
Nuôi trong môi trường nồng độ glucose cao 2.2. Quy trình thực hiện Kiểm tra nồng độ đường huyết ở các ngày 5, 10 và 15 Kiểm tra sự
hiện diện của insulin trong môi trường
Nhuộm DTZ mRNA MSC đông lạnh MSC Insulin IPC MSC thuần Insulin Đánh giá marker Giải đông
Biệt hóa thành tế bào mỡ
Biệt hóa
Realtime-PCR HPLC
2.3. Phương pháp
NỘI DUNG 1: CẢM ỨNG MSC-BM THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN
Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm cảm ứng MSC-BM thành tế bào tiết insulin