II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.3.3. Phương pháp chứng minh tiềm năng biệt hóa của MSC-BM
MSC-BM có khả năng chuyển biệt hóa thành nhiều loại tế bào khi được kích thích cũng như tác động giúp chúng chuyển biệt hóa. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, bằng cách sử dụng các môi trường có bổ sung các nhân tố kích thích biệt hóa,
các tế bào MSC-BM có thể được biệt hóa thành tế bào mỡ, nguyên bào xương, tế bào sụn [121].
2.3.3.1. Phương pháp biệt hóa MSC-BM thành tế bào mỡ
Nguyên tắc
Các MSC có thể biệt hóa thành tế bào mỡ [39], [115], [142], [155]. Một số chất như dexamethasone, indomethacin và ascorbate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy giúp cảm ứng MSC biệt hóa thành các tế bào mỡ. Các tế bào MSC sau khi được biệt hóa thành tế bào mỡ có thể được đánh giá sự biệt hóa bằng nhiều phương pháp, trong đó nhuộm tế bào để xác định sự hiện diện của các giọt mỡ trong tế bào chất là phương pháp phổ biến và dễ thực hiện. Thuốc nhuộm Oil Red được sử dụng để nhận diện sự hiện diện các giọt mỡ trong tế bào chất.
Quy trình tiến hành biệt hóa MSC-BM thành tế bào mỡ
(1) Tế bào đạt 80% độ bao phủ khi nuôi cấy lớp đơn thích hợp cho cảm ứng biệt hóa.
(2) Nuôi cấy trong khoảng 21-28 ngày và thay môi trường 2 lần/tuần (3) Nuôi cấy lớp đơn để cố định cho phân tích mô học. Ngoài ra, các hạt
lipid có thể nhìn thấy rõ vào ngày thứ 7 và có thể quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược.
Quy trình nhuộm phát hiện giọt mỡ trong tế bào chất bằng Oil Red
(1) Loại bỏ môi trường nuôi, rửa bằng PBS 2 lần (2) Cố định tế bào bằng ethanol 950 trong 15 phút
(3) Làm thấm màng bằng cách ủ với Triton X100 (5%) trong 30 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi, rửa lại với PBS 2 lần [8]
(4) Nhuộm tế bào với Oil Red (Sigma), ủ 10-20 phút (5) Loại bỏ thuốc nhuộm và rửa lại bằng nước khử ion (6) Xem kết quả dưới kính hiển vi đảo ngược
Đánh giá kết quả
Tế bào sau khi biệt hóa 21 ngày được đánh giá sự tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất và nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red. Kết quả dương tính với thuốc nhuộm, tức là có sự biện diện của các tế bào tích tụ những giọt mỡ được cho là quá trình biệt hóa thành công.
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá marker
Nguyên tắc
FACS (Flourescent Activated Cell Sorting) còn được gọi là phương pháp FCM (Flow cytometry) có thể được dịch là phương pháp dòng chảy tế bào. FCM là công nghệ cho phép định định lượng và phân tích nhiều đặc điểm của tế bào khi chúng chảy thành dòng xuyên qua một chùm ánh sáng. Các tính chất được định lượng bao gồm kích thước (Forward Scatter-FSC), tính chất hạt hoặc mức độ phức tạp bên trong (Side Scatter-SSC) và tín hiệu phát huỳnh quang. Các đặc điểm này được quyết định bởi việc sử dụng hệ thống đôi quang học – điện tử ghi nhận sự phát quang của tế bào. Như vậy, khi một tế bào đi qua chùm ánh sáng, tế bào được ghi nhận kích thước, độ đậm đặc/tính chất hạt của tế bào đồng thời dưới tác động của ánh sáng kích thích các kháng thể lai sẽ được phát hiện một cách hiệu quả.
Quy trình thực hiện
Quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry (theo hướng dẫn của BD BioScience). Tùy vào mục đích đánh giá, để chọn các kháng thể phù hợp ví dụ trong nghiên cứu này các marker được sử dụng nhằm phát hiện MSC.
(1) Thu nhận tế bào đơn từ flask nuôi cấy bằng Trypsin/EDTA, loại bỏ Trypsin bằng ly tâm (400 g trong 5 phút), rửa lại tế bào bằng PBS/BSA
(2) Xác định số lượng tế bào thu nhận được bằng máy ViCell (3) Huyền phù tế bào ở mật độ 1x106 tế bào/ml trong PBS/BSA
(4) Lần lượt nhuộm tế bào với kháng thể (có gắn với Flourochrome thích hợp) ở độ pha loãng thích hợp (theo hướng dẫn của Nhà sản xuất), trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút (tránh sáng), làm lạnh ở 4oC trong 10-15 phút
(5) Tiến hành “set up” máy FACS Calibur với các tế bào không đánh dấu kháng thể (unlabeled)
(7) Phân tích mẫu và sử dụng phần mềm CellQuest Pro để phân tích kết quả
Đánh giá kết quả
Vùng tế bào có kích thước tương ứng với tế bào đơn (FSC > 52) và dương tính với tín hiệu huỳnh quang được xác định trước khi phân tích mẫu tế bào. Tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính (nằm trong vùng đã được xác định trước) được tính toán một cách khách quan bằng phần mềm trên máy.