IV. BIỆN LUẬN
4.3. Đánh giá chức năng tiết in vitro
Kết quả MTT thể hiện cho thấy tế bào chết dần trong vi hạt (đến ngày thứ 15 phần trăm sống sót của tế bào < 40% so với ngày N0). Kết quả này được so sánh với công trình nghiên cứu của C. Stabler và cs (2001), tỷ lệ tế bào sống theo thời gian giảm dần. Trong công trình nghiên cứu tác giả sử dụng nguồi tế bào là βTC3 và vật liệu đóng gói là Alginate đã xác định rõ phần trăm hai loại acid G và M. Nghiên cứu khảo sát trong 80 ngày và cho thấy lượng tế bào trong hạt giảm dần, nhưng vẫn cao hơn so với nghiên cứu trong đề tài. Điều này có thể được giải thích bởi các nguyên nhân sau:
- Kích thước vi hạt tương đối lớn (500-1200 μm). Khi tế bào được trộn với Alginate hỗn hợp trở nên sệt, khó đi qua típ đóng gói, lực đẩy mạnh hơn do đó làm tăng kích thước của vi hạt.
Theo tác giả Mueller-Klieser thì việc khuếch tán thụ động các chất dinh dưỡng và chất thải trong các hạt Alginate phụ thuộc vào kích thước của
vi hạt. Các tiểu đảo không nên cách xa bề mặt quá 200 μm để đảm bảo sự hấp thu hiệu quả oxy và các chất dinh dưỡng. Theo nghiên cứu của Hallé, khoảng cách tốt cho sự khuếch tán và trao đổi giữa các tiểu đảo, kể cả các tiểu đảo ở trung tâm đến bề mặt chỉ nên ở khoảng 200-300 μm [45]. Do đó, kỹ thuật đóng gói đóng vai trò rất quan trọng để có thể tạo ra được những hạt có kích thước phù hợp.
Trong điều kiện cho phép, chúng tôi không sử dụng máy chuyên dụng dùng cho đóng gói, do đó kích thước vi hạt không đồng nhất. Thời gian đóng gói tế bào lâu, các vi hạt phơi trong dung dịch Barium lâu cũng là một nguyên nhân làm giảm sức sống của tế bào.
- Trước khi đóng gói, các cụm tế bào được phân tách khỏi bề mặt nuôi cấy bằng Trypsin. Nếu thời gian xử lý không đủ, các cụm tế bào không phân tách hoàn toàn, tính chất tế bào không đồng nhất. Khối tế bào đi qua típ đóng gói sẽ làm tăng kích thước của hạt. Nếu thời gian xử lý lâu, tế bào phân tách thành tế bào đơn, tuy nhiên việc xử lý với Trypsin lâu sẽ làm giảm sức sống của tế bào.
- Các vi hạt được nuôi trong điều kiện in vitro trong các đĩa nuôi cấy, môi
trường “tĩnh”. Sự trao đổi các chất vào và ra vỏ hạt phụ thuộc vào nồng độ các chất. Do đó, vi môi trường đối với hạt trở nên thu hẹp. Điều này có thể khắc phục nếu như các vi hạt được nuôi trong hệ thống lắc, nhằm tạo ra sự luân chuyển môi trường xung quanh hạt và gia tăng diện tích tiếp xúc với môi trường.
- Kết quả ảnh hưởng bởi thao tác thực hiện. Việc chuyển các vi hạt vào từng đĩa nuôi cấy dựa trên tỉ lệ tương đối. Do đó, số lượng vi hạt nuôi trong mỗi đĩa không giống nhau dẫn đến kết quả MTT không đồng đều theo thời gian.
Tiến hành định tính sự hiện diện của insulin trong môi trường nuôi vi hạt vào Kết quả kiểm tra sự hiện diện insulin (bằng định tính HPCL/MS) trong môi trường nuôi vi hạt vào ngày thứ 3 và ngày thứ 15. Kết quả cho thấy, vào ngày thứ 3 môi
trường có sự hiện diện của insulin, tuy nhiên vào ngày thứ 15 không có sự hiện diện của insulin. Điều này được giải thích bởi một số nguyên nhân sau:
- Insulin được phát hiện trong môi trường nuôi cấy vào ngày thứ 3. Trong môi trường nuôi cấy được kiểm tra là không có sự hiện diện của insulin, do đó insulin được phát hiện là do tế bào sản xuất. Điều này chứng tỏ, các tế bào tiết insulin trong vi hạt thực hiện được chức năng tiết insulin và insulin được tiết vào môi trường nuôi cấy. Đến ngày thứ 15, insulin không được phát hiện. - Nguyên nhân đầu tiên, lượng insulin được tiết vào môi trường ít, không đủ
lớn để gây tín hiệu trong phương pháp HPLC/MS.
- Trên thực tế sau 15 ngày khảo sát nuôi các vi hạt trong điều kiện in vitro cho thấy: các vi hạt trở nên mềm, kết dính thành từng khối, môi trường nuôi nhầy sau 2 ngày. Nguyên nhân được đưa ra được dựa trên đánh giá MTT, khi tế bào chết do quá trình trao đổi chất không đủ để cung cấp sẽ dẫn đến sự phân hủy tế bào, đồng thời sản xuất nhiều chất ức chế, gây độc cho các tế bào lân cận, ảnh hưởng đến quá trình sản xuất và tiết insulin của các tế bào còn sống. - Các tế bào được định hướng biệt hóa thành các tế bào tiết insulin đã ở trạng
thái biệt hóa hoàn toàn và thực hiện chức năng tiết insulin. Do đó, thời gian sống của tế bào trong điều kiện in vitro có giới hạn.
- Kết quả định tính HPLC/MS cũng cho thấy, trong môi trường nuôi có sự hiện diện của nhiều loại protein, chất khác (so với mẫu môi trường biệt hóa). Điều này phù hợp với thực tế có hiện tượng phân rã của các vi hạt. Đồng thời cho thấy sự sản xuất nhiều loại protein khi các tế bào chết dần.
Như vậy, các vi hạt nuôi trong điều kiện in vitro có khả năng sản xuất insulin và tiết insulin vào môi trường. Tuy nhiên, tế bào chết dần theo thời gian (sau 15 ngày chỉ có khoảng < 40% tế bào sống).