IV. BIỆN LUẬN
4.4. Đánh giá chức năng tiết in vivo
Chuột tạo mô hình cao đường huyết có tỷ lệ tử vong cao (kết quả không được thống kê) tuy nhiên mô hình được đánh giá là chuột cao đường huyết. Chuột
cao đường huyết được khẳng định dựa vào nồng độ đường huyết cao, ổn định trong thời gian dài (1 tuần sau khi cảm ứng bằng STZ). Đồng thời, kết quả nhuộm mô học cho tiểu đảo tụy cho thấy mật độ đảo tụy trong mô tụy giảm rõ rệt ở các con chuột cao đường huyết so với mô tụy chuột bình thường. Do đó, mô hình chuột cao đường huyết có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp sau.
Kết quả thử nghiệm ghép vi hạt chứa tế bào tiết insulin lên chuột bị cao đường huyết cho thấy: Lô đối chứng 1 không có sự giảm nồng độ đường huyết; Lô đối chứng 2 nồng độ đường huyết giảm nhanh sau 3 ngày và tăng vào các ngày tiếp theo; Lô thí nghiệm nồng độ đường huyết giảm dần sau 5 ngày và tăng nhẹ vào các ngày tiếp theo, tuy nhiên mức độ tăng ít hơn ở Lô đối chứng 2. Kết quả được biện luận thích như sau:
- Lô đối chứng 1 (tiêm hạt Alginate rỗng) không có biểu hiện khôi phục nồng độ đường huyết. Mô hình chuột được cảm ứng bằng STZ có thể dẫn đến tình trạng cao đường huyết trong thời gian dài [120].
- Lô đối chứng 2 (tiêm tế bào tiết insulin), nồng độ đường huyết giảm mạnh sau 3 ngày và tăng vào các ngày tiếp theo. Cấy ghép các tế bào tiết insulin trên mô hình chuột có khả năng điều tiết insulin và làm giảm nồng độ đường huyết [43], [52], [64], [74]. Các tế bào tiết insulin thu nhận từ người có tác dụng lên sự điều hòa đường huyết trên chuột [153]. Tuy nhiên, những tác giả trên cũng cho rằng, việc cấy ghép khác loài (xenograft) cần được kết hợp với việc gây suy giảm hệ thống miễn dịch. Thời gian tồn tại của các tế bào được cấy ghép bị giới hạn, vì sự tấn công của hệ thống miễn dịch, các tế bào dần bị cô lập, chết theo chương trình (apoptosis) và phân hủy [156]. Việc gây suy giảm hệ thống miễn dịch nhằm kéo dài thời gian tồn tại của tế bào ghép và các tế bào này có thể thực hiện được chức năng trong một khoảng thời gian nhất định.
Theo nghiên cứu cửa Wu và cs (2007) các tế bào tiết insulin được biệt hóa từ MSC-BM sau khi được tiêm vào tĩnh mạch đuôi đã di chuyển đến gan
và thực hiện chức năng tiết có hormone. Kết quả cho thấy có sự giảm đường huyết sau 6 ngày cấy ghép và duy trì đến ngày thứ 20 [149].
Trong thí nghiệm, chuột không được gây suy giảm miễn dịch, các vi hạt được cấy vào xoang bụng chuột. Vì vậy, các tế bào được cấy ghép có thể đã bị tấn công bởi hệ thống miễn dịch, tế bào dần mất chức năng, trong khi tuyến tụy chuột vẫn chưa phục hồi. Một số nghiên cứu cho rằng việc cấy ghép trực tiếp các tiểu đảo vào xoang bụng cần phải được tiến hành với một số lượng lớn ( trên 1000 tiểu đảo) để có được tác động điều hòa đường huyết rõ rệt [65], [102]. Trong nghiên cứu số lượng tế bào được ghép cho chuột là 106 tế bào tương ứng với khoảng 200 cụm tế bào giống tiểu đảo khi nuôi cấy. Số lượng này tương đối ít để lượng tế bào có thể tồn tại trong khoảng thời gian dài.
- Lô thí nghiệm (tế bào insulin được bọc trong vỏ Alginate), nồng độ đường huyết giảm dần sau 5 ngày, tăng nhẹ vào các ngày tiếp theo.
Cấy ghép vào xoang bụng cho thấy các tế bào tiết insulin được đóng góp có thể tồn tại lâu hơn, thực hiện chức năng tốt hơn so với các tiểu đảo “trần” [7], [101]. Các nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy, phương pháp cấy vào vùng bụng là phương pháp thích hợp nhất cho các vi hạt [102], [135]. Các tế bào trong vi hạt thực hiện được chức năng tiết insulin, trì hoãn sự tấn công của hệ miễn dịch, đồng thời cho phép cấy ghép được nhiều vi hạt hơn những vị trí ghép khác (như cấy ghép dưới da, cấy ghép dưới vỏ thận và cấy ghép vào tĩnh mạch).
Kết quả thí nghiệm cho thấy sự khác biệt rõ giữa Lô thí nghiệm và hai lô còn lại, điều này chứng tỏ các tế bào tiết insulin thực hiện được vai trò tiết insulin và làm giảm nồng độ đường huyết của chuột. Các tế bào trong vi hạt, một phần tiết insulin giúp điều hòa đường huyết cho chuột, mặt khác hỗ trợ quá trình phục hồi tuyến tụy của chuột [102].
Theo nghiên cứu của tác giả Bohman (2008), khi cấy ghép các tế bào tiểu đảo được đóng gói trong Alginate cũng có tác dụng làm giảm đường
huyết trong một tuần sau khi cấy ghép, sau đó đường huyết của chuột tăng nhẹ trong suốt 12 tuần sau đó. Trong thí nghiệm chuột được ghép vi hạt chứa tế bào tiết insulin chỉ được khảo sát trong 15 ngày, lượng tế bào sử dụng ghép ít hơn.
Thí nghiệm có kết quả tương đối phù hợp với nghiên cứu của tác giả Phan Kim Ngọc và cs (2011), cấy ghép tế bào tiết insulin đã được đóng gói (hay được cô lập miễn dịch) giúp điều hòa đường huyết trong 30 ngày. Nồng độ đường huyết trong lô thí nghiệm ghép tế bào tiết insulin đã được đóng gói giảm so với các thí nghiệm đối chứng.
Kết quả MTT đánh giá mức độ chuyển hóa của các vi hạt thu hồi từ chuột cho thấy tỷ lệ các tế bào sống trong vi hạt giảm so với thời điểm N0 sau đóng gói (<20%). Nguyên nhân:
- Số lượng vi hạt thu hồi từ chuột ít, các vi hạt có thể đã bị phân hủy cấu trúc gel trong quá trình trao đổi trong xoang bụng. Dạng gel được hình thành thông qua các cầu nối ion thường thiếu tính ổn định do tác động của các tác động cơ học và hóa học trong thời gian dài sau khi cấy ghép. Do có sự trao đổi giữa các cation và ion Na+ ở điều kiện sinh lý bình thường dẫn đến việc suy thoái dần dần theo thời gian của các vi hạt [59].
- Kiểm tra in vitro cho thấy tế bào có biểu hiện chết dần theo thời gian từ đó có thể rút ra kết luận, trong in vivo tế bào cũng có hiện tượng này. Dẫn đến việc suy thoái các hạt và mất dần chức năng tiết insulin.
- Các vi hạt trước khi cấy ghép được trộn với PBS. Thể tích trộn lớn sẽ dẫn đến việc làm tràn dịch trong xoang bụng, tuy nhiên nếu giảm bớt thể tích các vi hạt có hiện tượng ma sát và bám dính trên dụng cụ ghép. Do đó, thao tác ghép ảnh hưởng và kỹ thuật thu hồi cũng có ảnh hưởng lớn đến kết quả kiểm tra.
Từ kết quả thu hồi vi hạt từ chuột cho thấy số lượng vi hạt mất dần, đồng thời phần trăm tế bào sống giảm dần. Do đó, tác động tiết insulin giảm dần, khả năng điều hòa đường huyết giảm dần.
Như vậy, kết quả thử nghiệm in vivo tương đối phù hợp với kết quả nuôi cấy in vitro và kết quả kiểm tra vi hạt thu hồi từ chuột. Việc cấy ghép các tế bào tiết insulin “trần” và các tế bào tiết insulin được đóng gói giúp phục hồi nồng độ đường huyết. Các tế bào được cô lập miễn dịch (được đóng gói) có khả năng điều hòa đường huyết tốt hơn, đồng thời duy trì được chức năng tiết insulin trong thời gian lâu hơn. Tế bào giảm dần sức sống trong vi hạt do đó khả năng tiết insulin giảm dần.