II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.3.2. Phương pháp cấy chuyền, tăng sinh MSC-BM
Cấy chuyền là bước rất cần thiết nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào liên tục tăng sinh và phát triển. Mỗi loại tế bào có đặc trưng sinh trưởng và phát triển khác nhau. Do đó, tần số (độ thường xuyên cấy chuyền) và tỉ lệ pha loãng hay nồng độ tế bào phụ thuộc vào các đặc tính của mỗi dòng.
Nguyên tắc
Tế bào phát triển đến mật độ 80-90% bề mặt nuôi cấy sẽ được cấy chuyền nhằm phân bố lại mật độ tế bào. Trypsin/EDTA 0,25% được sử dụng để phân tách tế bào, sau đó được bất hoạt bởi môi trường có chứa huyết thanh và loại bỏ bằng phương pháp ly tâm. Tế bào đơn được pha loãng đến tỷ lệ phù hợp bằng môi trường nuôi cấy và phân bố diện tích nuôi cấy mới.
Quy trình tiến hành
(1) Loại bỏ môi trường cũ từ flask nuôi cấy
(2) Rửa tế bào bằng 5 ml PBS 1X kháng sinh, lặp lại 2 lần
(3) Bổ sung vào flask 0,5 ml dung dịch Trypsin/EDTA 0,25% đã được làm ấm đến 37oC, ủ bình flask trong tủ nuôi (37oC, 5% CO2) trong 2 phút
(4) Quan sát dưới kính hiển vi để xác định hiệu quả tách của Trypsin (các tế bào đơn khi được tách có dạng tròn và lơ lửng trong dung dịch)
(5) Bổ sung 3 ml môi trường DMEM/F12 15% FBS, huyền phù đều, chuyển toàn dịch huyền phù tế bào vào ly tâm, ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút
(6) Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 6 ml môi trường nuôi DMEM/F12 15% FBS, huyền phù đều, chuyển 3 ml dịch huyền phù vào 1 flask mới và nuôi ở 37oC, 5% CO2
(7) Thay môi trường sau 24 giờ, sau đó thay môi trường sau mỗi 72 giờ
Đánh giá kết quả
Dòng MSC-BM từ nguồn đông lạnh khá nhạy cảm với Trypsin và tăng trưởng tương đối chậm. Thao tác tách tế bào bằng Trypsin phải đảm bảo 100% tế bào được phân tách thành tế bào đơn. Thời gian tế bào xử lý với Trypsin ngắn và Trypsin được loại bỏ gần như hoàn toàn sau thao tác ly tâm và loại dịch nổi. Tế bào được phân bố đều theo tỉ lệ 1:2 (1 flask thành 2 flask) và bám lên bề mặt nuôi cấy sau 24 giờ. Thao tác thay môi trường sau 24 giờ cấy chuyền nhằm loại bỏ hoàn toàn Trypsin và cung cấp môi trường mới cho tế bào.