III. KẾT QUẢ
3.2. Kết quả chứng minh tiềm năng biệt hóa và marker của MSC-BM
3.2.1. Kết quả kiểm tra marker
Phần trăm tế bào biểu hiện dương tính được tính trên 10000 tế bào (sự kiện). Sự biểu hiện các marker được đánh giá như sau: dương tính “mạnh” khi phần trăm tế bào dương tính > 90%; âm tính yếu (dim) khi phần trăm tế bào dương tính < 2%.
Hình 3.2: Kết quả kiểm tra một số marker trên MSC-BM Nhận xét
MSC được kiểm tra sự biểu hiện của một số marker cho thấy sự biểu hiện mạnh các marker (Hình 3.2): CD90 (98,07%), CD44 (94,70%), CD13 (97,01%), CD166 (82,08%) và biểu hiện yếu (dim) các marker CD34 (0,31%), CD14 (3,83%), CD45 (2,92%) và HLA-DR (0,70%).
3.2.1. Kết quả biệt hóa MSC-BM thành tế bào mỡ
Quá trình các MSC chuyển biệt hóa thành các tế bào mỡ có thể được quan sát dưới kính hiển vi.
Hình 3.3 : Tế bào mỡ trước (A) và sau khi nhuộm Oil red (B) Nhận xét
Tế bào có biểu hiện co tròn và tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất, ban đầu là các giọt mỡ có kích thước nhỏ, sau đó các giọt mỡ này hợp thành các giọt mỡ lớn. Sự tích tụ các giọt mỡ làm cho tế bào trở nên căng phồng và có hình dạng tròn.
Các giọt mỡ được tích lũy trong tế bào và cho phản ứng dương tính (màu đỏ) với thuốc nhuộm Oil Red. Hình ảnh ghi nhận giống với kết quả nhuộm của một số nghiên cứu [39], [112], [150], [155].
3.3. Kết quả biệt hóa MSC-BM thành tế bào tiết insulin
Các MSC-BM có biểu hiện co tròn và co thành từng cụm có hình thái giống như các tiểu đảo (islet-like structures) [115]. Trong thí nghiệm, các cụm tế hình thành và lớn dần do sự tập hợp của các tế bào lân cận (Hình 3.4). Bên cạnh đó cũng có các tế bào chết, bong tróc khỏi bề mặt bình nuôi. Môi trường được thay mỗi 48 giờ, do đó các tế bào nổi được loại bỏ dần.
A C D E F B H G
Hình 3.4 : Hình thái MSC-BM trong quá trình được cảm ứng biệt hóa thành tế bào
tiết insulin. A. Sau 1 ngày, B. Sau 3 ngày; C. Sau 5 ngày; D. Sau 7 ngày; E. Sau 10 ngày; F. Sau 12 ngày. G, H. Cụm tế bào sau 12 ngày biệt hóa (5X và 10X)
3.3.1. Đánh giá sự biểu hiện mRNA
Sự biểu hiện các gen Pancreas duodenum homeobox-1 (Pdx1), Neuroginin3 (Ngn3), Insulin (Ils), Glucose transporter type 2 (Glut2) được sử dụng để xác định sự biệt hóa của các tế bào tiết insulin [53], [112], [122], [126].
Mức độ biểu hiện của các gen sau quá trình biệt hóa được so sánh với sự biểu hiện của các gen trước khi biệt hóa (các TBG trung mô tủy xương bình thường).
Hình 3.5: Bảng kết quả Realtime-PCR kiểm tra trên các tế bào tiết insulin gồm
bảng biểu thị giá trị Ct và biểu đồ khuếch đại dựa vào tín hiệu huỳnh quang
Nhận xét
Kết quả phân tích qPCR cho thấy, tế bào chưa biệt hóa không biểu hiện các gen Ils, Pdx1, Glut2 và Ngn3 ngược lại các gen này biểu hiện mạnh ở tế bào đã biệt hóa. Sự khác biệt này được so sánh theo công thức tính 2-∆∆Ct được biểu thị:
B
A C
Trong đó ∆∆Ct được tính dựa vào giá trị Ct của các gen
∆∆Ct=∆Ct(T) - ∆Ct(C)=[∆Ct(T/Tg) - ∆Ct(T/Ref)]-[∆Ct(C/Tg) - ∆Ct(C/Ref)] ∆Ct (T/Tg): chu kì ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu
∆Ct (T/Ref): chu kì ngưỡng của gen chứng dương (Ref) trong mẫu ∆Ct (C/Tg): chu kì ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu chứng
∆Ct (C/Ref): chu kì ngưỡng của gen chứng dương (Ref) trong mẫu chứng Mức độ biểu hiện của gen so với trước khi biệt hóa như sau (lấy gen đối nội là GAPDH2): Ils (15,53); Pdx1 (21,73); Ngn3 (16,24) và Glut2 (28,74).
3.3.2. Kết quả nhuộm tế bào tiết insulin bằng Dithizone
Các cụm tế bào giống tiểu đảo bắt màu đỏ với thuốc nhuộm DTZ cho thấy có sự hiện diện của insulin trong tế bào.
Hình 3.6: Kết quả nhuộm DTZ trên các cấu trúc giống đảo tụy trước khi nhuộm (A-
20X); sau khi nhuộm (B-5X; C-20X)
Nhận xét
Cụm tế bào cho kết quả dương tính với DTZ có hình thái giống với các cụm tế bào trong các nghiên cứu chuyển biệt hóa tạo tế bào tiết insulin từ nhiều nguồn tế bào gốc khác nhau [98], [115], [127], [139].
3.3.3. Kết quả định tính insulin trong môi trường nuôi cấy bằng HPLC/MS
Kết quả định tính bằng phương pháp HPLC/MS cho thấy trong môi trường nuôi đến ngày thứ 12 có sự hiện diện của insulin, Phụ lục 4. Insulin đặc trưng bởi ba đỉnh (peak) có độ lớn lần lượt: 5+ (A) 1147,7298; 4+ (A) 1434,4177; 3+ (A) 1911,9110.
Hình 3.7: Kết quả HPLC/MS insulin chuẩn (A); Môi trường nuôi tế bào tiết insulin
vào ngày thứ 12 (B); Môi trường cảm ứng biệt hóa (C)
A
Nhận xét
Kết quả HPLC/MS ghi nhận sự xuất hiện của hai đỉnh (4+ và 3+), được ghi nhận là dương tính với insulin, hay nói cách khác có sự hiện diện của insulin. Trong mẫu môi trường dùng cho cảm ứng MSC-BM thành tế bào tiết insulin được kiểm tra như là mẫu “thử không”, cho thấy không có sự hiện diện của insulin. Trong mẫu môi trường nuôi tế bào được cho là tế bào tiết insulin có hiện diện của insulin. Như vậy, insulin hiện diện trong môi trường nuôi tế bào là do tế bào tiết ra.
NỘI DUNG 2 : ĐÓNG GÓI TẾ BÀO TIẾT INSULIN TRONG VỎ ALGINATE
3.4. Kết quả tạo vi hạt bằng vật liệu Alginate ở các nồng độ 1%, 1,5% và 2%
Các vi hạt Alginate có hình khối cầu hoặc giọt nước. Các vi hạt có kích thước từ 400-900 µm (Hình 3.8).
Hình 3.8: Vi hạt Sodium-Alginate
3.4.1. Kích thước vi hạt
Kích thước vi hạt được ghi nhận trên 30 hạt ở mỗi nồng độ Sodium alginate. So sánh kích thước hạt ở mỗi nồng độ được biểu thị trên Hình 3.7, số liệu thô được trình bày ở Phụ lục 5.
Hình 3.9: Đồ thị so sánh kích thước vi hạt ở các nồng độ Sodium alginate Nhận xét
Các vi hạt ở nồng độ Alginate 1% và 1,5% có kích thước tương đương như nhau, tuy nhiên ở nồng độ Alginate 2% kích thước hạt tăng lên đáng kể (p<0,05).
3.4.2. Khả năng thẩm thấu của vi hạt
Sự thay đổi kích thước vi hạt được phân tích bằng phần mềm StatGraphic, so sánh được dựa trên giá trị Pvalue. Số liệu thô và xử lý kết quả trình bày ở Phụ lục 6.
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự thẩm thấu của vi hạt ở các nồng độ Sodium alginate
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 0 15 30 45 60 S ự t h ay đ ổi k ích thướ c so với thờ i đ iểm 0 p h ú t (% ) Phút Nồng độ 1% Nồng độ 1,5% Nồng độ 2% 594.367 602 781 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1 1,5 2 Kích thướ c vi hạt ( μ m) %
0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Số lượng (hạt) Phút Nồng độ 1% Nồng độ 1,5% Nồng độ 2% Nhận xét
Ở cả 3 nồng độ, các vi hạt thay đổi kích thước một cách rõ ràng trong 60 phút khảo sát ngâm trong nước.
Nồng độ Alginate 1%, các vi hạt hấp thu nước mạnh trong 15 phút đầu, sau đó hầu như giữ nguyên kích thước (p<0,05).
Nồng độ Alginate 1,5%, sự hấp thu nước diễn ra chậm hơn (kéo dài trong 30 phút đầu) tuy nhiên sự thay đổi này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Do đó, có thể kết luận rằng ở nồng độ 1,5% sự hấp thu nước chỉ diễn ra trong 15 phút đầu, sau đó hầu như không thay đổi (p<0,05).
Nồng độ Alginate 2%, sự hấp thu nước diễn ra chậm, cho đến phút thứ 45 mới có sự thay đổi về thể tích hạt và sau đó có khuynh hướng giữ nguyên thể tích (p<0,05).
3.4.3. Độ bền của vi hạt trước tác nhân Cation chelator
Khảo sát độ bền của 10 vi hạt được ủ với EDTA 200mM và ghi nhận số lượng hạt còn giữ hình dạng theo từng phút. Số liệu được trình bày ở Phụ lục 7.
Hình 3.11: Đồ thị độ bền của vi hạt ở các nồng độ Sodium alginate trước tác nhân
Nhận xét
Các vi hạt nồng độ 1% hoàn toàn “tan” sau 4 phút, các vi hạt 1,5% là 7 phút và 2% là 9 phút. Như vậy, nồng độ 2% có độ bền cao hơn so với 2 nồng độ còn lại (p<0,05).
3.5. Kết quả kiểm tra chức năng tiết của tế bào trong vi hạt ở điều kiện in vitro
Nồng độ Alginate 1,5% được sử dụng để đóng gói các tế bào tiết insulin. Các vi hạt chứa tế bào có kích thước tương đối lớn (500 μm < vi hạt < 1200 μm), hình khối cầu hoặc giọt nước, bề mặt căng và tách rời nhau (Hình 3.12). Kích thước hạt chứa tế bào tương đối giống kết quả nghiên cứu của Omer A. và cs (2004). Tỷ lệ trộn (tế bào:Alginate) là 105 tế bào:100 μl Alginate, thu được khoảng 50 đến 80 vi hạt và được nuôi trong một giếng trên đĩa 24 giếng.
Hình 3.12: Tế bào được đóng gói trong vi hạt, nồng độ Alginate 1,5%
3.5.1. Đánh giá mức độ chuyển hóa của tế bào trong vi hạt
Kết quả đo MTT vi hạt ở các ngày N0, N5, N10 và N15 được trình bày ở
Phụ lục 8. Đồ thị thể hiện phần trăm tế bào sống sót so với ngày N0, tức thời điểm
-80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 0 5 10 15 T ỷ lệ t ế b ào sốn g so vớ i n gày N0 (% ) Ngày
Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn phần trăm sống sót của tế bào trong vi hạt khi được
nuôi cấy in vitro ở các ngày 0, 5, 10 và 15
Nhận xét
Dựa vào đồ thị cho thấy tỷ lệ tế bào sống vào các ngày 5, 10 và 15 giảm dần (p<0,05). Kết quả “âm” biểu thị tỷ lệ tế bào sống giảm so với thời điểm ban đầu. Đến ngày thứ 15, lượng tế bào còn sống trong vi hạt thấp hơn 40%.
3.5.2. Kiểm tra chức năng tiết insulin của tế bào trong vi hạt
Đánh giá kết quả tương tự với phương pháp đánh giá kết quả mục 3.3.3. và Phụ lục 4.
Hình 3.14: Kết quả HPLC/MS insulin chuẩn (A); Môi trường nuôi vi hạt chứa tế
bào tiết insulin vào ngày thứ 3 (B); Môi trường nuôi vi hạt chứa tế bào tiết insulin vào ngày thứ 15 (C)
A
C B
A B
Nhận xét
Kết quả HPLC/MS cho thấy, trong môi trường nuôi vi hạt chứa tế bào vào này thứ 3 có sự hiện diện của insulin. Trong môi trường nuôi vi hạt chứa tế bào vào ngày thứ 15 có xuất hiện nhiều đỉnh của nhiều chất, tuy nhiên không có các đỉnh đặc trưng của insulin.
3.6. Kết quả kiểm tra chức năng tiết của tế bào đóng gói trong điều kiện in vivo
(trên mô hình chuột cao đường huyết)
Kết quả đánh giá chức năng tiết của tế bào trong vi hạt dựa trên khả năng điều hòa đường huyết trên chuột bị cao đường huyết và tỷ lệ phần trăm sống sót của tế bào trong vi hạt
3.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột bị cao đường huyết
STZ tác động lên tế bào β của tuyến tụy, gây ra hiện tượng tiêu biến dần các tiểu đảo trong tuyến tụy. Chuột được chọn làm mô hình cho thí nghiệm có biểu hiện nồng độ đường huyết cao và duy trì trong thời gian dài (7 ngày). Mô tụy được sinh thiết từ chuột cao đường huyết và chuột bình thường (đối chứng), cắt lát mỏng (7 µm) và nhuộm DTZ (Hình 3.15). Số liệu cho quy trình tạo mô hình chuột không được trình bày.
Hình 3.15: Mô tụy chuột được nhuộm DTZ. Mô tụy chuột bình thường X40 (A);
Nhận xét
Trên lát mô ở chuột bình thường có các vùng bắt màu đỏ (vùng tiểu đảo). Mật độ các đảo tụy ở chuột bị cao đường huyết ít hơn ở mô tụy chuột bình thường. Như vậy, chuột bị cao đường huyết có biểu hiện bị tổn thương tuyến tụy, số lượng các tiểu đảo giảm so với chuột bình thường.
3.6.2. Kết quả kiểm tra khả năng tiết insulin của tế bào đóng gói
Nồng độ đường huyết được ghi nhận ở các ngày N0, N3, N5, N7 và N15, số liệu và xử lý kết quả được trình bày ở Phụ lục 9.
Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn nồng độ đường huyết trên chuột vào các ngày 0, 3, 5, 7 và 15 Nhận xét
Dựa vào đồ thị và kết quả xử lý số liệu cho thấy:
- Nồng độ đường huyết ở cả 3 lô thí nghiệm đều cao hơn so với nồng độ đường huyết của chuột bình thường (từ N0 đến N15) (p<0,05).
- Lô đối chứng 1 (ghép vi hạt) nồng độ đường huyết không đổi trong 15 ngày khảo sát (p<0,05).
- Lô đối chứng 2 (ghép tế bào tiết insulin) nồng độ đường huyết giảm nhanh đến ngày N3 và hầu như không thay đổi vào các ngày tiếp theo (p<0,05).
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 3 5 7 15 Nồng đ ộ đ ườ n g h u yế t (m g/d L ) Ngày Lô đối chứng 1 Lô đối chứng 2 Lô kiểm tra Chuột bình thường
- Lô kiểm tra (ghép vi hạt chứa tế bào) nồng độ đường huyết giảm dần cho đến ngày N5 và hầu như không thay đổi vào các ngày tiếp theo (p<0,05).
So sánh giữa các lô thí nghiệm cho thấy:
- Sự giảm nồng độ đường huyết ở Lô kiểm tra thấp hơn Lô đối chứng 1 và Lô đối chứng 2 (p<0,05).
- Lô đối chứng 2 giảm so với Lô đối chứng 1, giảm mạnh vào ngày N3 so với Lô kiểm tra. Tuy nhiên, vào các ngày tiếp theo nồng độ đường huyết Lô đối chứng 2 tăng so với Lô kiểm tra (p<0,05).
3.6.3. Kết quả thu hồi vi hạt từ chuột
Lượng vi hạt thu hồi từ chuột chỉ bằng khoảng 20% lượng vi hạt được ghép lên chuột. Phần trăm tế bào sống sót trong vi hạt thu hồi được tính theo thời điểm N0 của mục 3.5.1 (đánh giá in vitro) và so sánh với phần trăm tế bào sống sót trong vi hạt vào ngày N15 của Mục 3.5.1.
Bảng 3.4: Kết quả MTT vi hạt thu hồi từ chuột
Vi hạt thu hồi từ chuột Tỷ lệ % tế bào
sống so với ngày N0 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Con 1 0,0366 0,0350 0,0357 0,035766667 -73,51271 Con 2 0,0214 0,0225 0,0235 0,022466667 -83,36213 Con 3 0,0090 0,0050 0,0050 0,006333333 -95,30980 -84,06155 Nhận xét
Kết quả “âm” biểu thị tỷ lệ tế bào sống giảm so với thời điểm ban đầu. Phần trăm tế bào sống sót trong các vi hạt được thu hồi từ chuột (~20%), thấp hơn so với các vi hạt được nuôi trong điều kiện in vitro (~40%).
IV. BIỆN LUẬN
NỘI DUNG 1: CẢM ỨNG MSC-BM THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN 4.1. Cảm ứng biệt hóa MSC-BM thành tế bào tiết insulin
Các MSC-BM được tăng sinh, một phần được mang đi kiểm tra các đặc tính của tế bào gốc trung mô và một phần được sử dụng cho các thí nghiệm chính. Các MSC-BM được kiểm tra tiềm năng biệt hóa thành tế bào mỡ và sự biểu hiện các protein đặc trưng của tế bào (hay còn được gọi là marker).
Kết quả cho thấy dòng MSC-BM sau giải đông biểu hiện một số marker: CD90+, CD44+, CD13+, CD166+ và CD34-, CD14-, CD45- và HLA-DR-.
Các marker CD34, CD14, CD45 thường được sử dụng để chứng minh cho các tế bào máu và biểu hiện yếu hoặc không biểu hiện ở TBG trung mô [126]. Marker CD14, receptor lipopolysaccharide, là marker đặc trưng cho các tế bào đơn nhân, đại thực bào macrophage và tế bào tiền thân nội mô. Marker CD34, glycoprotein, được biểu hiện ở giai đoạn phát triển sớm của các tế bào gốc tạo máu (hematopoietic) và tế bào nội mô. Marker CD45, tyrosine phosphate, các kháng nguyên bạch cầu, biểu hiện mạnh ở các tế bào bạch cầu trưởng thành. HLA-DR, được biết đến như phân tử tương hợp mô lớp II, biểu hiện ở các tế bào đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu và có vai trò trình diện kháng nguyên ngoại lai cho tế bào T (CD4) [106].
Mặt khác, marker CD13, aminopeptidase N (APN), là một protein bám dính bề mặt, biểu hiện trên nhiều dòng tế bào như đại thực bào, tế bào đơn nhân, tế bào biểu mô. Marker CD13 được sử dụng để định danh TBG trung mô và một số tế bào có nguồn gốc từ lớp trung phôi bì [148]. Marker CD90 hay Thy-1, một glycoprotein bề mặt, được cho là một protein quan trọng để nhận diện TBG trung mô từ tủy xương, máu cuống rốn, dây rốn và một số nguồn khác [82], [90]. Marker CD44 và CD166 là những phân tử protein bề mặt giúp cho quá trình bám dính của tế bào, được sử dụng phổ biến để nhận diện MSC phân lập từ máu cuống rốn, mô mỡ và tủy xương [75].
Tế bào MSC-BM biểu hiện khả năng biệt hóa thành tế bào mỡ và biểu hiện các marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô. Như vậy, các tế bào MSC-BM sau