II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.1. Hóa chất-dụng cụ
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguồn tế bào gốc trung mô phân lập từ tủy xương người (mesenchymal stem cell derived from bone marrow-MSC-BM) được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Tế bào gốc. Tế bào được bảo quản trong Nitrogen -196oC.
Chuột sử dụng để làm mô hình cao đường huyết được mua từ Viện Pasteur, Thành phố Hồ Chí Minh và nuôi tại Phòng thí nghiệm Tế bào gốc.
2.1.2. Dụng cụ
Bảng 2.1: Các dụng cụ sử dụng trong quá trình thí nghiệm
STT Tên dụng cụ Hãng sản
xuất Nước sản xuất
1 Bình Roux 25 cm2, 75 cm2 Nunc Đan Mạch
2 Micropipette 100-1000 µl, 10-100 µl Eppendorf Đức 3 Eppendorf 100 µl, 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml Kartell Pháp
4 Kim tiêm insulin B.Braun Đức
5 Đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng, 24 giếng Nunc Đan Mạch 6 Màng lọc vô trùng 0,2 µm, 0,45 µm Minisart Hoa kỳ
7 Ống ly tâm 15 ml, 50 ml Corning Hoa Kỳ
8 Đầu típ 1 ml, 0,1 ml, 10 µl; típ đóng gói tế bào
9 Các dụng cụ khác: Duran, becher, erlen, kéo, kẹp, cá từ….
Típ đóng gói tế bào Kim tiêm insulin
2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2: Các thiết bị đặc trưng được sử dụng trong quá trình thí nghiệm
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược Olympus Nhật Bản 2 Tủ nuôi cấy lắc (Orbital incubator) Stuart-BioCare Anh
3 Máy Realtime PCR Eppendorf Đức
4 Máy FACS Calibur BD Bioscience Mỹ
5 Máy DTX 880 Beckman Coulter Mỹ
6 Máy ViCell Analysis BD Bioscience Mỹ
2.1.4. Hóa chất và môi trường 2.1.4.1. Hóa chất 2.1.4.1. Hóa chất
Thuốc nhuộm Oil Red: 0,1 g Oil Red (Sigma) pha trong 20 ml Isopropanol
(Merck), khuấy đều trong 10 phút ở 37oC, lọc bằng giấy lọc Whatman.
Thuốc nhuộm Dithizol (DTZ): 10 mg Dithizol (Merck) pha trong 10 ml
DMSO, lọc bằng giấy lọc Whatman, sử dụng trong vòng 24 giờ
Hóa chất tách RNA tổng số (Kit easy-BLUE) (Intron)
Hóa chất Realtime PCR: (Kit SYBR Green Quantitative RT-PCR)
(Stratagene)
Hóa chất Flow cytometry: Sheath Fluid; FACSflow; Kháng thể: CD166,
CD90, CD44, CD13, CD34, CD14, CD45, HLA-DR (BD Bioscience, San Jose, CA).
2.1.4.2. Môi trường
Môi trường DMEM/F12 15% FBS
Môi trường DMEM/F12 bổ sung 15% FBS được sử dụng để nuôi tế bào MSC-BM. Bột DMEM/F12 (Sigma) 3,9 g
L- glutamine 2,5 ml
HEPES 5 ml
NaHCO3 7,5 % 3,75 ml
Phenol red 0,5 ml
Môi trường dạng bột được pha trong nước cất, khuấy cho đến khi bột tan hoàn toàn, chuẩn pH môi trường đến 7,2 và định mức thể tích đến 1l, lọc qua màng lọc minipore 0,22 m và trữ ở -4oC.
Môi trường đánh giá khả năng biệt hóa của MSC
DMEM low glucose được bổ sung FBS 10%; Kháng sinh 1%; Dexamethasone 0,5 µM; 3-Isobutyl-1-methylxanthin-IBMX 0,5 µM; Indomethacin 50 µM; Ascorbic acid 50 µg.
Bảo quản 40C, sử dụng trong 1 tuần
Môi trường biệt hóa MSC thành tế bào tiết insulin
H-DMEM/F12 được bổ sung; Nicotinamide 10 nM; β-Mecaptoethanol 1mM; Transferrin 50 µg/ml; Retionic acid 0,1 nM; FBS 15%; Kháng sinh 1%. Trong đó, Retionic acid được pha trong DMSO ở nồng độ 1000X
Bảo quản 4oC, sử dụng trong 4 tuần.
Môi trường nuôi vi hạt trong điều kiện in vitro
Vi hạt có chứa tế bào được nuôi trong điều kiện in vitro trong môi trường có nồng độ đường cao (DMEM High-glucose) (Nồng độ glucose 25mM) bổ sung 15% FBS và 1% kháng sinh.
MSC-BM
Kiểm tra in vitro
Vi hạt có tế bào tiết insulin
Tế bào tiết insulin Nồng độ Alginate thích hợp Đánh giá khả năng thẩm thấu của vi hạt Alginate Đánh giá sự biểu hiện mRNA Đánh giá sự hiện diện insulin Tế bào tiết insulin
Đánh giá độ bền với
tác nhân Chelator
Kiểm tra in vivo
Kiểm tra hoạt động chuyển hóa của tế bào trong vi hạt thu
nhận từ chuột sau 15 ngày Kiểm tra hoạt
động chuyển hóa của tế bào trong vi hạt sau 5, 10 và 15 ngày
1% 1,5% 2%
- Kiểm tra khả năng biệt hóa - Kiểm tra marker
- Cảm ứng biệt hóa bằng hóa chất
Ghép vào chuột bị cao đường huyết
Kích thước của vi hạt
Nuôi trong môi trường nồng độ glucose cao 2.2. Quy trình thực hiện Kiểm tra nồng độ đường huyết ở các ngày 5, 10 và 15 Kiểm tra sự
hiện diện của insulin trong môi trường
Nhuộm DTZ mRNA MSC đông lạnh MSC Insulin IPC MSC thuần Insulin Đánh giá marker Giải đông
Biệt hóa thành tế bào mỡ
Biệt hóa
Realtime-PCR HPLC
2.3. Phương pháp
NỘI DUNG 1: CẢM ỨNG MSC-BM THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN
Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm cảm ứng MSC-BM thành tế bào tiết insulin
2.3.1. Phương pháp giải đông MSC-BM từ nguồn tế bào đông lạnh
Nguyên tắc
Tế bào được bảo quản đông lạnh trong môi trường có chứa DMSO và giữ ở nhiệt độ -196oC. Thao tác giải đông nhằm loại bỏ hoàn toàn DMSO và nuôi tế bào mới giải đông trong môi trường giàu dinh dưỡng.
Quy trình thực hiện
(1) Rã đông ống đông lạnh tế bào trong bể ổn nhiệt ở 37oC (2) Chuyển huyền phù tế bào vào ống ly tâm
(3) Nhỏ giọt môi trường giải đông DMEM/F12 30-40% FBS vào ống ly tâm, thể tích môi trường gấp ba lần thể tích huyền phù tế bào đông lạnh
(4) Ly tâm ở vận tốc 1000 vòng/phút, trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi
(5) Bổ sung môi trường giải đông DMEM/F12 30-40% FBS vào và huyền phù nhẹ nhàng cặn tế bào, chuyển huyền phù tế bào vào flask, nuôi ở 37oC, 5% CO2
(6) Sau 24 giờ, thay môi trường nuôi bình thường DMEM/F12 15% FBS
Đánh giá kết quả
Tế bào sau khi giải đông có hình dạng tròn, bề mặt căng, tế bào chất màu sáng đều. Sau 24 giờ, tế bào khỏe sẽ bám lên bề mặt nuôi cấy, các tế bào chết chưa bám và lượng DMSO dư trong dịch nuôi cấy sẽ được loại bỏ ở lần thay môi trường đầu tiên.
2.3.2. Phương pháp cấy chuyền, tăng sinh MSC-BM
Cấy chuyền là bước rất cần thiết nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào liên tục tăng sinh và phát triển. Mỗi loại tế bào có đặc trưng sinh trưởng và phát triển khác nhau. Do đó, tần số (độ thường xuyên cấy chuyền) và tỉ lệ pha loãng hay nồng độ tế bào phụ thuộc vào các đặc tính của mỗi dòng.
Nguyên tắc
Tế bào phát triển đến mật độ 80-90% bề mặt nuôi cấy sẽ được cấy chuyền nhằm phân bố lại mật độ tế bào. Trypsin/EDTA 0,25% được sử dụng để phân tách tế bào, sau đó được bất hoạt bởi môi trường có chứa huyết thanh và loại bỏ bằng phương pháp ly tâm. Tế bào đơn được pha loãng đến tỷ lệ phù hợp bằng môi trường nuôi cấy và phân bố diện tích nuôi cấy mới.
Quy trình tiến hành
(1) Loại bỏ môi trường cũ từ flask nuôi cấy
(2) Rửa tế bào bằng 5 ml PBS 1X kháng sinh, lặp lại 2 lần
(3) Bổ sung vào flask 0,5 ml dung dịch Trypsin/EDTA 0,25% đã được làm ấm đến 37oC, ủ bình flask trong tủ nuôi (37oC, 5% CO2) trong 2 phút
(4) Quan sát dưới kính hiển vi để xác định hiệu quả tách của Trypsin (các tế bào đơn khi được tách có dạng tròn và lơ lửng trong dung dịch)
(5) Bổ sung 3 ml môi trường DMEM/F12 15% FBS, huyền phù đều, chuyển toàn dịch huyền phù tế bào vào ly tâm, ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút
(6) Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 6 ml môi trường nuôi DMEM/F12 15% FBS, huyền phù đều, chuyển 3 ml dịch huyền phù vào 1 flask mới và nuôi ở 37oC, 5% CO2
(7) Thay môi trường sau 24 giờ, sau đó thay môi trường sau mỗi 72 giờ
Đánh giá kết quả
Dòng MSC-BM từ nguồn đông lạnh khá nhạy cảm với Trypsin và tăng trưởng tương đối chậm. Thao tác tách tế bào bằng Trypsin phải đảm bảo 100% tế bào được phân tách thành tế bào đơn. Thời gian tế bào xử lý với Trypsin ngắn và Trypsin được loại bỏ gần như hoàn toàn sau thao tác ly tâm và loại dịch nổi. Tế bào được phân bố đều theo tỉ lệ 1:2 (1 flask thành 2 flask) và bám lên bề mặt nuôi cấy sau 24 giờ. Thao tác thay môi trường sau 24 giờ cấy chuyền nhằm loại bỏ hoàn toàn Trypsin và cung cấp môi trường mới cho tế bào.
2.3.3. Phương pháp chứng minh tiềm năng biệt hóa của MSC-BM
MSC-BM có khả năng chuyển biệt hóa thành nhiều loại tế bào khi được kích thích cũng như tác động giúp chúng chuyển biệt hóa. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, bằng cách sử dụng các môi trường có bổ sung các nhân tố kích thích biệt hóa,
các tế bào MSC-BM có thể được biệt hóa thành tế bào mỡ, nguyên bào xương, tế bào sụn [121].
2.3.3.1. Phương pháp biệt hóa MSC-BM thành tế bào mỡ
Nguyên tắc
Các MSC có thể biệt hóa thành tế bào mỡ [39], [115], [142], [155]. Một số chất như dexamethasone, indomethacin và ascorbate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy giúp cảm ứng MSC biệt hóa thành các tế bào mỡ. Các tế bào MSC sau khi được biệt hóa thành tế bào mỡ có thể được đánh giá sự biệt hóa bằng nhiều phương pháp, trong đó nhuộm tế bào để xác định sự hiện diện của các giọt mỡ trong tế bào chất là phương pháp phổ biến và dễ thực hiện. Thuốc nhuộm Oil Red được sử dụng để nhận diện sự hiện diện các giọt mỡ trong tế bào chất.
Quy trình tiến hành biệt hóa MSC-BM thành tế bào mỡ
(1) Tế bào đạt 80% độ bao phủ khi nuôi cấy lớp đơn thích hợp cho cảm ứng biệt hóa.
(2) Nuôi cấy trong khoảng 21-28 ngày và thay môi trường 2 lần/tuần (3) Nuôi cấy lớp đơn để cố định cho phân tích mô học. Ngoài ra, các hạt
lipid có thể nhìn thấy rõ vào ngày thứ 7 và có thể quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược.
Quy trình nhuộm phát hiện giọt mỡ trong tế bào chất bằng Oil Red
(1) Loại bỏ môi trường nuôi, rửa bằng PBS 2 lần (2) Cố định tế bào bằng ethanol 950 trong 15 phút
(3) Làm thấm màng bằng cách ủ với Triton X100 (5%) trong 30 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi, rửa lại với PBS 2 lần [8]
(4) Nhuộm tế bào với Oil Red (Sigma), ủ 10-20 phút (5) Loại bỏ thuốc nhuộm và rửa lại bằng nước khử ion (6) Xem kết quả dưới kính hiển vi đảo ngược
Đánh giá kết quả
Tế bào sau khi biệt hóa 21 ngày được đánh giá sự tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất và nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red. Kết quả dương tính với thuốc nhuộm, tức là có sự biện diện của các tế bào tích tụ những giọt mỡ được cho là quá trình biệt hóa thành công.
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá marker
Nguyên tắc
FACS (Flourescent Activated Cell Sorting) còn được gọi là phương pháp FCM (Flow cytometry) có thể được dịch là phương pháp dòng chảy tế bào. FCM là công nghệ cho phép định định lượng và phân tích nhiều đặc điểm của tế bào khi chúng chảy thành dòng xuyên qua một chùm ánh sáng. Các tính chất được định lượng bao gồm kích thước (Forward Scatter-FSC), tính chất hạt hoặc mức độ phức tạp bên trong (Side Scatter-SSC) và tín hiệu phát huỳnh quang. Các đặc điểm này được quyết định bởi việc sử dụng hệ thống đôi quang học – điện tử ghi nhận sự phát quang của tế bào. Như vậy, khi một tế bào đi qua chùm ánh sáng, tế bào được ghi nhận kích thước, độ đậm đặc/tính chất hạt của tế bào đồng thời dưới tác động của ánh sáng kích thích các kháng thể lai sẽ được phát hiện một cách hiệu quả.
Quy trình thực hiện
Quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry (theo hướng dẫn của BD BioScience). Tùy vào mục đích đánh giá, để chọn các kháng thể phù hợp ví dụ trong nghiên cứu này các marker được sử dụng nhằm phát hiện MSC.
(1) Thu nhận tế bào đơn từ flask nuôi cấy bằng Trypsin/EDTA, loại bỏ Trypsin bằng ly tâm (400 g trong 5 phút), rửa lại tế bào bằng PBS/BSA
(2) Xác định số lượng tế bào thu nhận được bằng máy ViCell (3) Huyền phù tế bào ở mật độ 1x106 tế bào/ml trong PBS/BSA
(4) Lần lượt nhuộm tế bào với kháng thể (có gắn với Flourochrome thích hợp) ở độ pha loãng thích hợp (theo hướng dẫn của Nhà sản xuất), trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút (tránh sáng), làm lạnh ở 4oC trong 10-15 phút
(5) Tiến hành “set up” máy FACS Calibur với các tế bào không đánh dấu kháng thể (unlabeled)
(7) Phân tích mẫu và sử dụng phần mềm CellQuest Pro để phân tích kết quả
Đánh giá kết quả
Vùng tế bào có kích thước tương ứng với tế bào đơn (FSC > 52) và dương tính với tín hiệu huỳnh quang được xác định trước khi phân tích mẫu tế bào. Tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính (nằm trong vùng đã được xác định trước) được tính toán một cách khách quan bằng phần mềm trên máy.
2.3.4. Phương pháp biệt hóa MSC-BM thành tế bào tiết insulin 2.3.4.1. Phương pháp biệt hóa 2.3.4.1. Phương pháp biệt hóa
Nguyên tắc
Sử dụng các tác nhân cảm ứng biệt hóa MSC thành tế bào tiết insulin như glucose, sodium selenite, N2, B27, nicotinamide, β-Mecaptoethanol, retinoic acid, transferrin….đã được công bố trên nhiều công trình nghiên cứu [80], [112], [115]. Thành phần các nhân tố kích thích và cảm ứng biệt hóa được sử dụng được điều chỉnh phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
Quy trình tiến hành
(1) MSC-BM đồng nhất và mật độ phủ trên bề mặt nuôi cấy > 80% được nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tiết insulin (2) Môi trường được thay 2 ngày 1 lần, trong 12 ngày
Đánh giá kết quả
Các MSC có phản ứng co tròn và hình thành nên các cụm (cluster) có cấu trúc giống với các tiểu đảo. Kết quả của quá trình biệt hóa được kiểm tra ở các mức: sự biểu hiện protein ở mức phiên mã bằng PCR định lượng (qPCR) bằng phương pháp Realtime-PCR; sự biểu hiện protein ở mức dịch mã bằng nhuộm phát hiện sự
tồn tại của insulin trong tế bào bằng phương pháp nhuộm DTZ, sự tồn tại của insulin trong môi trường nuôi bằng phương pháp HPLC.
2.3.4.2. Phương pháp kiểm tra tế bào tiết insulin
Các tế bào tiết insulin được xác định ở nhiều mức độ. Đánh giá sự biểu hiện insulin ở mức phiên mã bằng phương pháp Realtime-PCR. Đánh giá sự biểu hiện insulin ở mức độ dịch mã bằng phương pháp nhuộm với Dithizone, hoặc định tính bằng phương pháp HPLC/MS.
Phương pháp đánh giá thông qua sự biểu hiện mRNA bằng Realtime-PCR
Nguyên tắc
Sự biểu hiện mRNA được đánh giá bằng phương pháp Realtime-PCR cho phép định tính và định lượng sự biểu hiện gen thông qua đánh giá sự hiện diện của gen trên tổng số các gen đang được biểu hiện trong tế bào.
RNA tổng số cần phải được phân tách từ quần thể tế bào cần kiểm tra. Thông qua phản ứng Reverse transcriptase bằng enzyme phiên mã ngược AMV cho phép chuyển tất cả mRNA thành cDNA (DNA complement). Sau đó, sự biểu hiện của các gen mục tiêu được định lượng bằng phương pháp Realtime-PCR bằng việc sử dụng các cặp mồi để khuếch đại đoạn gen cần kiểm tra.
Phương pháp tách RNA tổng số
Tế bào bị phá vỡ bằng các tác nhân phá màng, sau đó RNA tổng số được tinh sạch bằng cách loại bỏ những thành phần tạp nhiễm như DNA, protein. Tách chiết RNA tổng số dựa trên nguyên tắc sự hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol/chloroform:nước). Thao tác tách chiết nhanh, duy trì mẫu trong điều kiện lạnh. RNA tổng được xác định nồng độ và được sử dụng ngay sau khi tách chiết.
Quy trình tách RNA tổng số: (theo hướng dẫn của bộ kit easy-BLUE, Intron)
(1) Chuẩn bị 1-10 x 105 tế bào. Ly tâm loại bỏ môi trường. Huyền phù cặn trong 1 ml easy BLUE, vortex ở nhiệt độ phòng trong 10 giây (2) Bổ sung 200 µl Chloroform và vortex nhẹ
(3) Ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, chuyển 400 µl dịch nổi vào eppendorf khác
(4) Bổ sung 400 µl isopropanol và huyền phù đều. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng
(5) Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi (6) Bổ sung 1 ml ethanol và đảo eppendorf 2-3 lần. Ly tâm ở tốc độ
10000 vòng trong 5 phút ở 40C. Loại bỏ dịch nổi và để khô cặn (7) Huyền phù cặn RNA vào 20-50 µl nước DEPC