II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.3.4. Phương pháp biệt hóa MSC-BM thành tế bào tiết insulin
2.3.4.1. Phương pháp biệt hóa
Nguyên tắc
Sử dụng các tác nhân cảm ứng biệt hóa MSC thành tế bào tiết insulin như glucose, sodium selenite, N2, B27, nicotinamide, β-Mecaptoethanol, retinoic acid, transferrin….đã được công bố trên nhiều công trình nghiên cứu [80], [112], [115]. Thành phần các nhân tố kích thích và cảm ứng biệt hóa được sử dụng được điều chỉnh phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
Quy trình tiến hành
(1) MSC-BM đồng nhất và mật độ phủ trên bề mặt nuôi cấy > 80% được nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tiết insulin (2) Môi trường được thay 2 ngày 1 lần, trong 12 ngày
Đánh giá kết quả
Các MSC có phản ứng co tròn và hình thành nên các cụm (cluster) có cấu trúc giống với các tiểu đảo. Kết quả của quá trình biệt hóa được kiểm tra ở các mức: sự biểu hiện protein ở mức phiên mã bằng PCR định lượng (qPCR) bằng phương pháp Realtime-PCR; sự biểu hiện protein ở mức dịch mã bằng nhuộm phát hiện sự
tồn tại của insulin trong tế bào bằng phương pháp nhuộm DTZ, sự tồn tại của insulin trong môi trường nuôi bằng phương pháp HPLC.
2.3.4.2. Phương pháp kiểm tra tế bào tiết insulin
Các tế bào tiết insulin được xác định ở nhiều mức độ. Đánh giá sự biểu hiện insulin ở mức phiên mã bằng phương pháp Realtime-PCR. Đánh giá sự biểu hiện insulin ở mức độ dịch mã bằng phương pháp nhuộm với Dithizone, hoặc định tính bằng phương pháp HPLC/MS.
Phương pháp đánh giá thông qua sự biểu hiện mRNA bằng Realtime-PCR
Nguyên tắc
Sự biểu hiện mRNA được đánh giá bằng phương pháp Realtime-PCR cho phép định tính và định lượng sự biểu hiện gen thông qua đánh giá sự hiện diện của gen trên tổng số các gen đang được biểu hiện trong tế bào.
RNA tổng số cần phải được phân tách từ quần thể tế bào cần kiểm tra. Thông qua phản ứng Reverse transcriptase bằng enzyme phiên mã ngược AMV cho phép chuyển tất cả mRNA thành cDNA (DNA complement). Sau đó, sự biểu hiện của các gen mục tiêu được định lượng bằng phương pháp Realtime-PCR bằng việc sử dụng các cặp mồi để khuếch đại đoạn gen cần kiểm tra.
Phương pháp tách RNA tổng số
Tế bào bị phá vỡ bằng các tác nhân phá màng, sau đó RNA tổng số được tinh sạch bằng cách loại bỏ những thành phần tạp nhiễm như DNA, protein. Tách chiết RNA tổng số dựa trên nguyên tắc sự hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol/chloroform:nước). Thao tác tách chiết nhanh, duy trì mẫu trong điều kiện lạnh. RNA tổng được xác định nồng độ và được sử dụng ngay sau khi tách chiết.
Quy trình tách RNA tổng số: (theo hướng dẫn của bộ kit easy-BLUE, Intron)
(1) Chuẩn bị 1-10 x 105 tế bào. Ly tâm loại bỏ môi trường. Huyền phù cặn trong 1 ml easy BLUE, vortex ở nhiệt độ phòng trong 10 giây (2) Bổ sung 200 µl Chloroform và vortex nhẹ
(3) Ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, chuyển 400 µl dịch nổi vào eppendorf khác
(4) Bổ sung 400 µl isopropanol và huyền phù đều. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng
(5) Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi (6) Bổ sung 1 ml ethanol và đảo eppendorf 2-3 lần. Ly tâm ở tốc độ
10000 vòng trong 5 phút ở 40C. Loại bỏ dịch nổi và để khô cặn (7) Huyền phù cặn RNA vào 20-50 µl nước DEPC
(8) Xác định nồng độ và mẫu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -80o
C
Phương pháp chạy Realtime PCR bằng kit One-step PCR kết hợp SYBR Green Nguyên tắc
Phản ứng Realtime PCR được sử dụng để đánh giá (định tính và định lượng)
sự biểu hiện gen ở mức độ phiên mã mRNA. Chất nhuộm DNA được sử dụng là chất phát màu huỳnh quang SYBR Green (Stratagene). Chất nhuộm SYBR Green gắn lên các mẫu DNA mạch đôi. Do đó, khi chu kì ở giai đoạn kéo dài (enlongation) khi các DNA khuôn được kéo dài thành mạch đôi, các chất nhuộm gắn vào và phát tín hiệu huỳnh quang. Đến chu kỳ biến tính DNA đôi tách ra, chất nhuộm cũng tách ra và mất tín hiệu. Dựa vào tín hiệu huỳnh quang máy có thể phân tích và ghi nhận khi có phản ứng tổng hợp mạch mới. Phản ứng Realtime-PCR luôn được tiến hành với gen “housekeeping genes” (thường là glyceraldehyde-3- phosphate-dehydrogenase (GAPDH) hoặc β-actin) được sử dụng như gen chứng nội “endogenous control” [62]. Trình tự mồi được bổ sung ở Phụ lục 3.
Quy trình tiến hành
(1) Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (Tổng thể tích phản ứng là 25 μl)
Master SYBR Green Mix (SYBR Green, AVM, dNTP, oligo T primer, Taq polymerase, và PCR buffer) 2X 12,5 μl
Mồi xuôi (0,1 μM) 1 μl Mồi ngược (0,1 μM) 1 μl RNA template (0,3 μg) 2 μl Nước 8,5 μl (2) Chu trình Realtime-PCR: 48oC trong 30 giây 42 oC trong 45 phút 95 oC trong 10 phút 94 oC trong 30 giây 55 oC trong 30 giây 72 oC trong 30 giây Melting curve Hold 4 oC Đánh giá kết quả
Kết quả định lượng được cung cấp chính xác từ phần mềm của thiết bị. Hai thông số Ct (Threshold cycle) và Tm (Melting temparature) được sử dụng làm cơ sở để đánh giá sự biểu hiện gen.
Phương pháp đánh giá thông qua sự sản xuất insulin a. Phương pháp nhuộm DTZ
Nguyên tắc
Các phân tử thuốc nhuộm Dithizone đóng vai trò như các Chelator bắt giữ các phân tử kẽm (Zinc) hiện diện trong mẫu được kiểm tra. Khi phức hợp
Dithizone-Zn được tạo thành sẽ cho phản ứng tạo màu (màu đỏ) dễ dàng quan sát bằng kính hiển vi.
a) Dithizone (DTZ) (b) Phức hợp Dithizone-Zn
Hình 2.3: Công thức phân tử Dithizone và phức hợp Dithizone-Zn
Quy trình thực hiện
(1) Rửa tế bào với PBS, 2 lần
(2) Ủ tế bào 30 giây với Ethanol 95o, hút bỏ Ethanol
Xử lý tế bào bằng Triton-X100 5% trong 30 phút, hút bỏ Triton-X100, rửa tế bào với PBS, 2 lần [8]
(3) Ủ tế bào với thuốc nhuộm Dithizone (Merck) trong 1 giờ (4) Quan sát kết quả bằng kính hiển vi
Đánh giá kết quả
Tế bào có hiện diện insulin sẽ cho phản ứng dương tính với thuốc nhuộm (màu đỏ) (thuốc nhuộm DTZ có màu cam) có thể quan sát rõ ràng dưới kính hiển vi.
b. Phương pháp định tính bằng HPLC/MS Nguyên tắc
HPLC/MS (High performance liquid chromatography/Mass spectrometry), sắc ký lỏng cao áp kết hợp phổ khối, phương pháp phân tích dựa vào khối phổ kết hợp sắc ký cột (column chromatography). Dung môi nhỏ giọt qua một cột ghi sắc ký dưới tác dụng của trọng lực và áp suất 400 atm, các dung môi di chuyển qua cột
sắc kí nhằm tách rời các chất. Các phân tử sau đó được tích điện thành các ion. Các ion tiếp tục đi qua ống tĩnh điện, mỗi ion đặc trưng bởi tỷ số m/z (khối lượng/điện tích) và được ghi nhận thành từng peak trên phổ đồ. Phương pháp này cho phép sử dụng các hạt có kích thước nhỏ trong cột hấp phụ (column packing material) và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh (stationary phase) và các phân tử đi qua nó. Do đó, các dung dịch đi qua cột sẽ được ghi nhận thành một chuỗi các phân tử hiện diện trong mẫu, từ đó cho biết thành phần các chất trong hỗn hợp.
Quy trình thực hiện
Mẫu môi trường được thu từ môi trường nuôi các tế bào IPC vào ngày thứ 12 của quá trình cảm ứng biệt hóa, môi trường nuôi vi hạt chứa tế bào sau 15 ngày và mẫu đối chứng sử dụng môi trường dùng để biệt hóa. Bảo quản trong -20oC, sau cùng gửi đến Trung tâm phân tích, trường Đại học Khoa học tự nhiên để phân tích.
Đánh giá kết quả
Kết quả đánh giá có hay không sự hiện diện của insulin trong môi trường được so sánh với protein chuẩn dựa trên các đỉnh xuất hiện trong hỗn hợp phân tích. Bảng kết quả được gửi từ Trung tâm phân tích.
NỘI DUNG 2 : ĐÓNG GÓI TẾ BÀO TIẾT INSULIN TRONG VỎ ALGINATE
Bước 1 : Khảo sát khả năng thẩm thấu và tính bền của các vi hạt ở nồng độ
Alginate 1%, 1,5% và 2%. Nồng độ tốt nhất sẽ được chọn cho Bước 2.
Bước 2 : Khảo sát hoạt động chuyển hóa và chức năng tiết của vi hạt chứa tế bào
Hoạt động chuyển hóa trong vi hạt
Alginate 1,5%
Nồng độ
đường huyết Chức năng tiết insulin
Đóng gói Đĩa vi hạt chứa tế bào HPLC Sau 15 ngày IPC
Chuột cao đường huyết Mức độ chuyển hóa trong vi hạt In vivo In vitro Vi hạt Ghép vi hạt
Đo nồng độ đường huyết N0, N3, N5, N7, N15
Nuôi trong H-DMEM
MTT Sau 15 ngày
MTT N0, N5, N10, N15