II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.3.5. Phương pháp đóng gói tế bào vào vỏ Alginate
2.3.5.1. Phương pháp đóng gói tế bào vào vỏ Alginate
Nguyên tắc
Các phân tử Alginate là các polymer đồng phân tuyến tính của hai loại acid
-D-mannuronic (kí hiệu là M) và -L-guluronic (kí hiệu là G). Các chuỗi acid M và G được liên kết lại nhờ các ion dương hóa trị hai (ví dụ: Ca2+
, Ba2+, Sr2+, Mg2+) hình thành nên dạng hydrogel.
Thao tác đóng gói được thực hiện bằng cách đẩy hỗn hợp Alginate đi qua típ có đường kính 20 m, cách mặt thoáng ~1 mm, lực đẩy đều cho đến hết hỗn hợp.
Hình 2.5: Sự kết gel của các phân tử -L-guluronic (G) khi có sự hiện diện của cation Ca2+
Quy trình thực hiện
(1) Trộn tế bào với tỉ lệ 105 tế bào : 100 µl Alginate, chuyển hỗn hợp vào típ đóng gói
(2) Đẩy hỗn hợp với một lực đều vào becher chứa 20 ml hỗn hợp đóng gói(50 mM BaCl2, 0,15 M Mannitol) đang được khuấy đều.
(3) Khuấy các vi hạt trong hỗn hợp đóng gói trong 5 phút (4) Rửa các vi hạt với PBSA, 2 lần để loại bỏ hoàn toàn Barium
Đánh giá kết quả
Vi hạt đều, bề mặt căng và tách rời từng hạt. Các vi hạt được đo kích thước bằng phần mềm ghi ảnh nối trực tiếp với kính hiển vi.
2.3.5.2. Phương pháp đánh giá khả năng thẩm thấu của vi hạt
Đánh giá khả năng thẩm thấu đối với nước của vi hạt khi sử dụng nồng độ Sodium-Alginate là 1%, 1,5% và 2%.
Nguyên tắc
Vỏ Alginate đảm bảo sự trao đổi chất được diễn ra giữa bên trong và bên ngoài hạt. Nước có thể thẩm thấu vào hạt dễ dàng đồng thời làm hạt căng phồng. Mức độ thẩm thấu được đánh giá thông qua sự thay đổi kích thước của hạt khi được ngâm trong nước [119].
Quy trình thực hiện
Các vi hạt sau khi đóng gói được rửa với PBS và chuyển vào đĩa 96 giếng (mỗi giếng 1 vi hạt). Kích thước ban đầu của từng hạt được ghi nhận bằng thước đo của kính hiển vi. Vi hạt được ủ trong nước khử ion (ion-free water) trong 60 phút, ghi nhận kích thước các vi hạt sau mỗi 15 phút. Thí nghiệm được khảo sát từ 10-15 hạt, và lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ Sodium-Alginate.
Đánh giá kết quả
Nước đi từ ngoài vào trong vi hạt làm kích thước hạt thay đổi. Sự hấp thụ phụ thuộc vào khả năng thẩm thấu của vi hạt. Ở mỗi nồng độ khác nhau lớp vỏ vi hạt cho phép lượng nước đi vào khác nhau thể hiện qua sự thay đổi kích thước hạt.
2.3.5.3. Phương pháp kiểm tra độ bền của vi hạt với tác nhân Cation Chelator
Khảo sát độ bền của các vi hạt ở các nồng độ Sodium-Alginate 1%, 1,5% và 2% khi được phơi trong tác nhân phân rã gel (EDTA).
Nguyên tắc
Phương pháp đánh giá này dựa trên quá trình tự nhiên trong cơ thể. Khi các vi hạt được cấy ghép vào cơ thể, chúng bị tác động bởi hệ thống dịch tiết cũng như sự trao đổi ion trong quá trình trao đổi chất dẫn đến hiện tượng các vi hạt bị phân rã dần.
EDTA đóng vai trò như các Chelator bắt giữ các ion hóa trị hai hiện diện trong dung dịch. Các phân tử Alginate gồm acid -D-mannuronic (kí hiệu là M) và
-L-guluronic (kí hiệu là G) khi ngâm trong EDTA sẽ bị phân tách và không tạo thành liên kết hydrogel. Vì vậy, các vi hạt khi ngâm trong dung dịch EDTA sẽ bị “tan” dần. Đánh giá phản ứng phân rã với EDTA cho biết độ bền tương đối của vi hạt đối với tác nhân hóa học.
Quy trình thực hiện
(1) Mỗi vi hạt được chứa trong 1 giếng trên đĩa 96 giếng (2) Bổ sung 100 ml dung dịch EDTA 200 mM
(3) Quan sát và ghi nhận số lượng vi hạt còn kết cấu dạng hạt (tròn) ở mỗi phút, trong 10 phút
Bố trí thí nghiệm: Khảo sát trên 10 vi hạt ở mỗi nồng độ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ.
Đánh giá kết quả
So sánh số lượng các vi hạt bền theo thời gian ở mỗi nồng độ. Các vi hạt giữ được cấu trúc dạng hạt lâu trong EDTA được đánh giá là có tính bền hơn. Kết quả đánh giá thể hiện trong ba nồng độ Alginate khảo sát (1%, 1,5% và 2%) nồng độ nào bền hơn đối với tác nhân Cation chaletor.
2.3.5.4. Phương pháp kiểm tra chức năng chuyển hóa của tế bào trong vi hạt
Sử dụng phương pháp thử nghiệm MTT kiểm tra hoạt động chuyển hóa của các tế bào trong vi hạt thông qua đánh giá mức độ tăng sinh của các tế bào ở các thời điểm 5, 10, 15 ngày so với thời điểm sau khi đóng gói.
Nguyên tắc
Các tế bào sau khi được đóng gói vẫn có khả năng sống và tăng sinh trong vi hạt. Phương pháp định lượng MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide] dựa trên hoạt động của enzyme khử Hydro của ti thể (bằng cách tạo nên sự cân bằng giữa NADH và NADPH). Enzyme trong ti thể của các tế bào sống có thể phân tách các tetrazolium - vòng trong dung dịch MTT (màu vàng nhạt) hình thành các tinh thể formazan màu xanh đậm/tím. Các tinh thể formazan không có khả năng thấm qua màng do đó chúng được giữ lại bên trong các tế bào sống. Bước tiếp theo, dung dịch hòa tan (MTT solvent) được bổ sung nhằm hòa tan các các tế bào đồng thời hòa tan các tinh thể formazan. Độ đậm nhạt
Ủ 10-15 phút 37oC
Ủ 5-10 phút, 37oC Lắc 6 giờ, 37oC 5x105 tế bào + 100 l Sodium-Alginate/giếng
trên đĩa 24
Bổ sung 100 l MTT solution vào 900 l
Hút bỏ dung dịch từ giếng nuôi cấy
500 l EDTA 200mM
1000 l MTT solvent
Huyền phù đều và chuyển 120 l huyền phù vào một giếng trên đĩa 96
Đo biểu hiện màu bằng máy DTX
0 giờ 5 ngày 10 ngày 15 ngày
của dung dịch thể hiện tỉ lệ tế bào sống. Bằng cách ghi nhận phổ ánh sáng và so màu thể hiện lượng tế bào sống trong mẫu được khảo sát.
Hình 2.6: Sơ đồ thực hiện kiểm tra chức năng chuyển hóa của tế bào trong vi hạt
Quy trình thực hiện
Thí nghiệm được bố trí: 2x106 tế bào được trộn trong 400 l Sodium- Alginate và đóng gói trong dung dịch kết gel. Các vi hạt chứa tế bào được rửa 3 lần bằng PSB nhằm loại bỏ hoàn toàn Barium dư, sau đó được chuyển vào 4 giếng trên đĩa 24 giếng. Vi hạt chứa tế bào được nuôi trong môi trường H-DMEM/F12, bổ sung 15% FBS và 1% kháng sinh. Tiến hành định lượng MTT vào các thời điểm 0 giờ, 5 ngày, 10 ngày và 15 ngày sau đóng gói. Thí nghiệm “chuẩn không” được so sánh với hạt không chứa tế bào. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Đánh giá kết quả
Giả thuyết số lượng tế bào được phân bố đều trong các vi hạt và lượng vi hạt trong mỗi giếng tương đương như nhau. Định lượng MTT tại các thời điểm ngày N5, N10 và N15 được so sánh với thời điểm 0 giờ (N0) sau khi đóng gói thể hiện mức độ tăng sinh của các tế bào trong vi hạt khi được nuôi cấy in vitro.
2.3.6. Phương pháp kiểm tra khả năng sản xuất insulin của vi hạt trong điều kiện in vitro
Các tế bào trong vi hạt vẫn duy trì được khả năng tiết insulin. Vi hạt chứa tế bào được nuôi trong môi trường H-DMEM (high glucose DMEM) nhằm kích thích các tế bào trong vi hạt tiết insulin. Khi insulin được sản xuất sẽ theo cơ thế thẩm tách để thấm ra ngoài môi trường nơi có nồng độ insulin thấp hơn. Định tính sự hiện diện insulin trong môi trường nuôi ở ngày N15 bằng phương pháp HPLC/MS tương tự mục 2.4.3.2 (b).