II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.3.7. Phương pháp kiểm tra chức năng của tế bào đóng gói trong điều kiện in
vivo
Các vi hạt được cấy vào bụng, vùng tụy-tá tràng trên chuột bị cao đường huyết và khảo sát trong 15 ngày sau khi cấy ghép. Các vi hạt chứa tế bào tiết insulin được cho là vẫn tiết insulin và insulin từ tế bào ghép khuếch tán vào trong máu, điều hòa lượng đường huyết của chuột. Trong thí nghiệm, chuột ghép được theo dõi nồng độ đường huyết trong 15 ngày.
Bảng 2.3: Cấy ghép vi hạt chứa tế bào tiết insulin trên chuột bị cao đường huyết
Lô thí nghiệm Mục đích Số lượng (con)
1) Đối chứng 2 Ghép vi hạt (vỏ hạt) 3
2) Đối chứng 3 Ghép tế bào tiết insulin 3
2.3.7.1. Phương pháp tạo mô hình chuột bị cao đường huyết bằng STZ
Nguyên tắc
Streptozotocin (STZ) (C8H15N3O7, khối lượng mol: 265,221 g/mol) là hỗn hợp của α và β stereoisomer, dạng bột kết tinh màu xám vàng hoặc trắng đục.
Khi được đưa vào đường tĩnh mạch, nồng độ STZ trong huyết tương nhanh chóng giảm xuống trong vòng 15 phút và tập trung ở gan và thận. Khoảng 20% thuốc (chuyển hóa nhóm chứa N-nitrosourea) được chuyển hóa hoặc được bài tiết ra bởi thận. STZ có cấu trúc giống glucose và được vận chuyển vào bên trong tế bào thông qua kênh GLUT2 (Glucose transporter 2) nhưng không được vận chuyển bởi các protein vận chuyển khác. Điều này giải thích mối liên hệ tác dụng gây độc giữa STZ và tế bào , vì những tế bào có nhiều GLUT2 trên bề mặt tế bào nhiều hơn các tế bào khác. STZ xâm nhập vào tế bào thông qua kênh GLUT2 và gây ra sự alkyl hóa DNA. Bước tiếp theo, các DNA bị alkyl hóa xúc tác các hoạt động của poly ADP-ribosylation. Poly ADP-ribosylation dẫn đến sự xóa bỏ hoàn toàn các NAD+ và ATP của tế bào. Kết quả của chuỗi phản ứng đó dẫn đến các tế bào bị hủy hoại.
STZ được pha trong DMSO, tránh sáng và sử dụng ngay.
Quy trình tiến hành
(1) Chuột Mus musculus var. Albino trưởng thành, 12 tuần tuổi được nuôi trong điều kiện PTN. Tế bào gốc. Chuột được cho nhịn ăn 6 tiếng trước khi kiểm tra đường huyết, hoặc tiêm STZ
(2) Chuột được tiêm STZ với liều 250 mg/kg/5ngày tức là 50 mg/kg/ngày (1,5 mg/ngày cho chuột 30 gram) theo đường tĩnh mạch (IV)
(3) Chuột được tiêm 0,1 ml Sucrose 10% vào xoang bụng (IP) ngay sau mỗi lần tiêm STZ
Máu được lấy từ tĩnh mạch đuôi và đo đường huyết bằng máy thử đường huyết (Accu-Chek Active) ở các ngày N0, N5, N10 và N15
Đánh giá kết quả
Chuột bình thường có nồng độ đường huyết là 97±39 mg/dL [57]. Chuột có nồng độ đường huyết trên 140 mg/dL được cho là chuột mắc chứng cao đường huyết. Chuột trong thí nghiệm sau khi được tiêm STZ sẽ kiểm tra đường huyết sau 7 ngày (sau ngày tiêm cuối cùng), chuột có nồng độ đường huyết cao sẽ được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.7.2. Phương pháp cấy ghép vi hạt vào mô hình chuột cao đường huyết
Nguyên tắc
Ghép các vi hạt chứa tế bào (tế bào tiết insulin) vào xoang bụng của chuột tại vị trí gần tuyến tụy và tá tràng. Chuột được gây mê bằng Zoletil nồng độ 0,1 mg/kg.
Quy trình tiến hành
(1) Gây mê chuột bằng Zoletil, cạo lông tại vị trí phẫu thuật, sát trùng bằng Povidine và gây tê cục bộ bằng Lidocain 10%
(2) Tạo một vết cắt nhỏ ~ 1 cm và cấy vi hạt bằng pipette pasteur
(3) Khâu vết mổ và sát trùng vết mổ, chăm sóc chuột trong điều kiện sạch (4) Chuột được ghép vi hạt chứa tế bào được kiểm tra đường huyết vào
các ngày N0, N5, N10 và N15
Đánh giá kết quả
Nồng độ đường huyết được kiểm tra bằng máy thử đường huyết (Accu-Chek Active). Lô kiểm tra được đánh giá kết quả bằng cách so sánh với các lô đối chứng 1, 2 và 3.
2.3.7.3. Phương pháp kiểm tra chức năng tế bào sau khi được thu hồi từ chuột
Nguyên tắc
Các vi hạt chứa tế bào được thu hồi từ chuột và kiểm tra chức năng chuyển hóa của các tế bào trong vi hạt bằng phương pháp MTT. Việc đánh giá mức độ
chuyển hóa của tế bào trong vi hạt còn cho biết tỉ lệ sống/chết của tế bào trong vi hạt.
Quy trình thực hiện
(1) Chuột được kéo giãn đốt sống cổ và giải phẫu mở vùng bụng (2) Dội rửa vùng bụng và thu hồi vi hạt
(3) Rửa vi hạt trong PBS
(4) Tiến hành kiểm tra bằng phương pháp MTT (tương tự mục 2.3.5.4)
Đánh giá kết quả
Thông số biểu thị mức độ chuyển hóa của các vi hạt được so sánh tương đối với thí nghiệm “Đánh giá hoạt động chức năng chuyển hóa của tế bào trong vi hạt” (mục 2.3.5.4).
B A