4.2.1. Về kết quả định tính
Kết quả định tính cho thấy:
- Trong tầm gửi Taxillus chinensis sống kí sinh trên cây Gạo có:
flavonoid, tanin, coumarin, saponin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid.
- Trong tầm gửi Macrosolen tricolor sống kí sinh trên cây Na có
flavonoid, tanin, coumarin, saponin, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, caroten.
Kết quả nghiên cứu trong luận án cũng tương tự như kết quả định tính
của một số tác giả nghiên cứu loài T. chinensis kí sinh trên cây Quất hồng bì [38], loài M. tricolor kí sinh trên cây Nhãn [25], loài M.cochinchinensis kí
sinh trên cây Mít [34], [44]. Tuy nhiên kết quả định tính các nhóm chất cũng có liên quan đến thành phần hóa học trong cây chủ, ví dụ như Nguyễn Thị
Mai Hương [26] định tính loài T.chinensis kí sinh trên cây Trúc đào phát hiện
phản ứng glycosid tim dương tính.
Nhiều tài liệu đều cho rằng flavonoid là thành phần chính trong các loài tầm gửi [32], [36], [42], [43], [73], [108],… Trong luận án xác định hàm lượng các chất chiết được trong dung môi ethylacetat vì dùng ethylacetat không chỉ chiết được flavonoid mà còn có một số nhóm chất khác có trong tầm gửi như coumarin, polyphenol,…
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng các chất trong phân đoạn chiết
bằng ethylacetat của tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis) đạt 0,9527%. Hàm
lượng các chất trong phân đoạn chiết bằng ethylacetat của tầm gửi cây Na
(Macrosolen tricolor) là 0,3589%. Qua đó cho thấy hàm lượng các chất tan trong ethylacetat (flavonoid, polyphenol, coumarin,…) ở loài Taxillus
chinensis kí sinh trên cây Gạo gấp 2,65 lần loài Macrosolen tricolor kí sinh
trên Na. Sự khác biệt này là do 2 loài tầm gửi khác nhau và cũng có thể còn do 2 cây chủ khác nhau. Điều đó cũng phù hợp với nhận xét của nhiều tác giả cho rằng hàm lượng các chất trong tầm gửi còn phụ thuộc vào cây chủ.
4.2.3. Về kết quả phân lập các hợp chất
Từ loài Taxillus chinensis (DC.) Dans., kí sinh trên cây Gạo đã phân
lập được 10 hợp chất TGGT1, TGGT2, TGGT3, TGGT5, TGGT7, TGGT8,
TGGT9, TGGT10, TGGT12, TGGT13. Từ loài Macrosolen tricolor
(Lecomte) Danser. kí sinh trên cây Na đã phân lập được 3 chất ký hiệu MT4A, MT2E1, MT5C1. Cấu trúc hóa học của 13 hợp chất được trình bày ở hình 4.1. O O O HO OH OH O OH CH3 OH OH OH 2 4 5 7 9 1' 3' 1'' 5'' 3" 5' 10 6" O O O OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 3' 5' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O CH3 OH OH OH
Catechin (TGGT3) Quercituron (Miquelianin) (TGGT5) HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 HO 17 18 19 20 22 5 24 26 27 28 29 3 (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E), 25- trien-3β-ol (TGGT7) β-sitosterol (TGGT8) OH 1 3 5 7 9 11 13 16 18 19 20 17 trans-phytol (TGGT9) O O OH 1 2 3 4 5 6 1' 3' 5' 7' 9' 11' 13' 15' α-tocopherolquinon (TGGT10)
Glycerol-1-(6,9,12- hexadecatrienoat)-2- (8,11,14-octadecatrienoat)- 3-O-β- D-galactopyranosid (TGGT12)
Glycerol-1-(9-hexadecanenoat)-2-(9,12-octadecadienoat)-3-O-β-D- galactopyranosid (TGGT13)
20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7β, 15α-diol (MT5C1) (mới)
3β-Hydroxylup-20(29)-ene (Lupeol) (MT2E1)
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 13 hợp chất
Trong 13 hợp chất đã phân lập được từ 2 loài Taxillus chinensis (DC.) Dans. và Macrosolen tricolor (L.) Dans. có 3 hợp chất thuộc nhóm flavonoid,
1 hợp chất thuộc cấu trúc tanin, 2 hợp chất thuộc nhóm sterol, 3 hợp chất có cấu trúc triterpen 5 vòng, 3 hợp chất có cấu trúc mạch thẳng, 1 hợp chất thuộc nhóm quinon.
Trong số những hợp chất này có hợp chất mới lần đầu tiên tìm thấy trong thiên nhiên là: 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7α-ol (MT4A) và hợp
chất 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7β, 15α-diol (MT5C1). Sở dĩ được xác định là hợp chất mới do căn cứ vào các tài liệu đã tham khảo và tra cứu trong Dictionary of Natural Products on DVD (1982-2009) [57] và trên mạng internet.
2 hợp chất là glycerol - 1 - (6,9,12 - hexadecatrienoat) - 2 - (8,11,14 - octadecatrienoat) - 3 - O - β - D - galactopyranosid (TGGT12) và glycerol -1- (9-hexadecanenoat)-2-(9,12-octadecadienoat)-3-O-β-D-galactopyranosid (TGGT13) cũng chưa tìm thấy tài liệu nào trong nước và trên thế giới công bố có trong thực vật.
4 hợp chất lần đầu tiên công bố phân lập được từ chi Taxillus là:
Quercituron (TGGT5), (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E), 25-trien-3β-ol (TGGT7), trans-phytol (TGGT9), α-tocopherolquinon (TGGT10).
4 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ loài Taxillus chinensis sống ký sinh
trên cây Gạo: Quercetin (TGGT1), Afzelin (TGGT2), Catechin (TGGT3), β- sitosterol (TGGT8).
1 hợp chất lần đầu tiên công bố phân lập được từ loài Macrosolen
tricolor sống ký sinh trên cây Na là lupeol.
4.3. VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 4.3.1.Về độc tính cấp
Cho từng lô chuột nhắt uống dịch chiết tầm gửi cây Gạo, tầm gửi Na với các liều tăng dần không có các triệu chứng biểu hiện độc trên hành vi hoạt động tự nhiên, trên hô hấp và tiêu hoá và trong thí nghiệm không có chuột nào chết nên không xác định được LD50. Như vậy, gửi cây Gạo và tầm gửi cây Na có độ an toàn cao cho người sử dụng.
So sánh độc tính cấp của tầm gửi trong nghiên cứu của một số tác giả khác
Trần Thị Cẩm Thạch (2009) [38] nghiên cứu độc tính cấp của tầm gửi Taxillus
liều tăng dần từ 90g dược liệu/kg tới 270g dược liệu/kg thể trọng, không quan sát thấy biểu hiện bất thường nào ở chuột và không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ. Tiếp tục theo dõi trong 7 ngày sau uống thuốc, thấy chuột vẫn ăn uống, hoạt động, bài tiết bình thường không có biểu hiện gì đặc biệt. Vì vậy, chưa tính được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống.
Hoàng Văn Võ (2006) [44] đã cho chuột uống dịch chiết Macrosolen
cochinchinensis (Lour.) Blume ký sinh trên cây Mít với các liều tăng dần từ
tương đương 50g dược liệu/kg thể trọng chuột đến 300g dược liệu/kg thể trọng chuột vẫn không có chuột chết sau 72 giờ theo dõi. Chuột không có các triệu chứng biểu hiện độc trên hành vi hoạt động tự nhiên, trên hô hấp và tiêu hóa và không xác định được LD50 ở trên chuột nhắt trắng theo đường uống.
Qua đó cho thấy cùng loài Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo và kí
sinh trên cây Quất hồng bì đều không quan sát thấy biểu hiện bất thường ở chuột thí nghiệm và không xác định được LD50. Tầm gửi Macrosolen tricolor kí sinh trên cây Na không thấy biểu hiện độc tính cấp cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Hương [26]. Không xác định được LD50
của Macrosolen tricolor kí sinh trên cây Bưởi.
Vì điều kiện kinh phí, luận án mới tiến hành thử độc tính cấp. Để kết luận độ an toàn của dược liệu, khi sử dụng cần tiếp tục thử độc tính bán trường diễn, ảnh hưởng của dược liệu tới sự sinh sản và cấu trúc nhiễm sắc thể của động vật thí nghiệm. Những nội dụng này sẽ được thực hiện sau. 4.3.2. Về tác dụng sinh học
4.3.2.1. Về tác dụng chống oxy hóa
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp khử gốc
tự do DPPH của một số hợp chất phân lập được từ Taxillus chinensis (DC.)
Dans. ký sinh trên cây Gạo cho thấy hợp chất TGGT1 (3-O-α-L- Rhamnopyranosid quercetin (Quercitrin)), TGGT3 (catechin), TGGT5:
quercituron có hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH với giá trị SC50lần lượt là 40,87; 15,74; 13,31g/ml.
Kết quả này cũng tương tự như kết quả của một số tác giả nghiên cứu
tác dụng chống oxy hóa của một số loài tầm gửi chi Taxillus như:
Deng J. S. và cs. (2011) [55] nghiên cứu nghiên cứu hoạt tính dọn gốc tự do chống oxy hóa [2,2'-azino-bis (acid 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) (ABTS) và DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)] của dịch chiết ethanol
của loài Taxillus liquidambaricola (Hayata) Hosok. thấy hoạt tính loại gốc tự
do ABTS có giá trị TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity: khả năng chống oxy hóa tương đương với khả năng chống oxy hóa của Trolox) là 1063,53 ± 6,34 μg/mg. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH có nồng độ 50% tác dụng tối đa (EC50: Effective Concentration) là 88,72± 3,57 μg/ml.
Liu C. Y. và cs. (2012) [79] đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, của dịch
chiết nước, dịch chiết ethanol của Taxillus sutchuenensis (Lec.) Dans. thông
qua tác dụng dọn gốc tự do TEAC và DPPH thấy giá trị TEAC của dịch chiết nước là 57,04 ±0,58 mM/mg. Phân đoạn ethylacetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất (130,23 ±1,07 mM/mg), tiếp đến là phân đoạn chloroform (96,77 ±1,38 mM /mg), phân đoạn nước (69,73 ±0,26 mM /mg), phân đoạn n- butanol (37,02 ±0,19 mM/mg) và phân đoạn n- hexan (11,74 ±0,43 mM/mg). Phân đoạn ethylacetat có hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao nhất với giá trị IC50 là 93,32 ± 0,94 mg/ml.
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của tầm gửi cây Gạo
(Taxillus chinensis) ở mô hình gây tăng MDA trên chuột nhiễm độc
Paracetamol cho thấy hàm lượng MDA ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo liều 30g/kg và 60g/kg trong 8 ngày trước khi gây độc đã giảm rõ rệt so với lô uống PAR (p<0,05). Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi cây Gạo
liều 30g/kg và 60 g/kg (32,21% và 21,63%) tương đương với hoạt tính chống oxy hóa của Silymarin liều 70mg/kg (21,15%).
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của Macrosolen tricolor
(Lec.) Danser ký sinh trên cây Na ở mô hình gây tăng MDA trên chuột nhiễm độc Paracetamol cho thấy hàm lượng MDA ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi Na liều 30g/kg và 60 g/kg đều có giảm so với lô uống PAR nhưng sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi cây Na liều 30g/kg và 60 g/kg (16,35% và 15,87%) thấp hơn so với hoạt tính chống oxy hóa của Silymarin liều 70mg/kg (21,15%).
Hoạt tính chống oxy hóa của Macrosolen tricolor (Lec.) Danser ký sinh trên cây Na trong nghiên cứu tương đương với tầm gửi Macrosolen
cochinchinensis (Lour.) Blume ký sinh trên cây Mít trong nghiên cứu ở mô
hình gây tăng MDA ở gan bằng CCl4 của Hoàng Văn Võ (2006) [44] với hoạt tính chống oxy hoá là 13,59%.
Tuy nhiên, hoạt tính này thấp hơn so với chất TG2 (flavonoid toàn
phần của tầm gửi Macrosolen tricolor (Lec.) Dans. ký sinh trên cây Bưởi)
trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Hương (2002) [26]. Ở nồng độ 0,3 mg/ml có tác dụng ức chế phản ứng peroxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào gan chuột rõ rệt, hàm lượng MDA còn khoảng 56,2%. Với nồng độ TG2 từ 0,3- 0,5 mg/ml ức chế hầu như hoàn toàn phản ứng peroxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào não chuột, hàm lượng MDA duy trì ở mức 3,79 nmol- 2,8 nmol. Chất TG2 còn có tác dụng ức chế sự hình thành gốc tự do anion superoxid O2 khá mạnh, đạt tới 49,56% ở nồng độ rất thấp 25g/ml.
Hoạt tính chống oxy hóa Macrosolen tricolor (Lec.) Danser ký sinh trên cây Na cũng thấp hơn so với các loài tầm gửi chi Macrosolen trong
Rahman M. M. và cs. (2012) [99] thấy khả năng khử gốc tự do DPPH
của tầm gửi Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Van Tiegh. tối đa là
(39,47%) ở nồng độ 500 μg/ml. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của dịch chiết
methanol từ Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Van Tiegh. là 599,64 µg/ml,
còn giá trị IC50 của acid ascorbic là 48,38 μg/mL.
Sodde Vijay và cs. (2011) [103] cũng thấy giá trị IC50 của dịch chiết
methanol và dịch chiết nước tầm gửi Macrosolen parasiticus (L.) Dans. là
79,67 μg/ml và 54,32 μg/ml đối với dọn gốc tự do DPPH; 50,12 μg/ml và 35,12 μg/ml đối với dọn gốc tự do superoxid; 40,08 μg/ml và 28,56 μg/ml đối với thử nghiệm giảm năng lượng tiêu thụ; 86,65 μg/ml và 83,39 μg/ml đối với thử nghiệm O-phenanthrolin; 152,53 μg/ml và 102,43 μg/ml đối với dọn gốc tự do nitric oxid. Giá trị IC50 của acid ascorbic đối với các thử nghiệm trên lần lượt là 13,15 μg/ml; 5,45 μg/ml; 9,15 μg/ml; 13,43 μg/ml và 23,87 μg/ml.
Sở dĩ tầm gửi cây Gạo có tác dụng chống oxy hóa cao là do có chứa các hợp chất: quercitrin, afzelin, catechin, quercituron, α-tocopherolquinon. Do có bản chất là polyphenol, nên các flavonoid thường có tính chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn thương do gốc tự do một cách hữu hiệu. Bên cạnh hoạt tính chống oxy hóa, flavonoid còn có khả năng ức chế một số enzyme oxy hóa khử như cyclooxygenase, lipoxygenase và nicotinamid adenin dinucleotid phosphate (NADPH) oxydase [19], [67].
Ở cấp tế bào, một trong những đặc tính hữu ích nhất của flavonoid là trung hòa các gốc tự do – nhờ vào cấu trúc hóa học cũng như sự liên kết chặt chẽ của nó với màng tế bào; flavonoid bảo vệ Low-density lipoprotein (LDL) chống lại sự oxy hóa ở giai đoạn khởi đầu của sự peroxyd hóa lipid. Flavonoid gắn vào bề mặt của phân tử LDL hình thành liên kết ether làm giới hạn sự tấn công mạnh mẽ của các tác nhân oxy hóa và các gốc tự do. Do vậy,
flavonoid có thể bảo vệ tế bào chống lại các tổn thương do các gốc tự do rất hiệu quả [19], [67], [83].
4.3.2.2. Về tác dụng bảo vệ gan
Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan bị tổn thương do Paracetamol
của tầm gửi Taxillus chinensis (DC.) Dans. ký sinh trên cây Gạo cho thấy liều
60g/kg có tác dụng hạn chế tăng trọng lượng gan. Hoạt độ enzym AST, ALT ở lô chuột uống tầm gửi cây Gạo liều 30g/kg và 60g/kg trong 8 ngày trước khi gây độc gan đã giảm rõ rệt so với lô uống PAR, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Tác dụng hạn chế tăng hoạt độ enzym AST và ALT của tầm gửi cây Gạo liều 30g/kg (giảm 72,15% và 65,10%), liều 60g/kg (71,21% và 69,61%) tương đương với Silymarin liều 70mg/kg (giảm 72,68% và 72,90%), (Bảng 3.21 và 3.22).
Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ tổn thương gan do Paracetamol của
tầm gửi Macrosolen tricolor (Lec.) Danser ký sinh trên cây Na cho thấy với
liều 30g/kg có tác dụng hạn chế tăng trọng lượng gan. Hoạt độ enzym AST, ALT ở lô chuột uống tầm gửi cây Na liều 30g/kg và 60g/kg trong 8 ngày trước khi gây độc gan đã giảm rõ rệt so với lô uống PAR, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Tác dụng hạn chế tăng hoạt độ enzym AST và ALT của tầm gửi cây Na liều 30g/kg (giảm 74,26% và 68,48%), liều 60g/kg (74,22% và 66,04%) tương đương với Silymarin liều 70mg/kg (giảm 72,68% và 72,90%), (Bảng 3.21 và 3.22).
Kết quả nghiên cứu mô bệnh học của gan chuột uống tầm gửi cây Gạo và cây Na cũng cho thấy các nhóm chuột uống tầm gửi cây Gạo, tầm gửi cây Na đều có mức độ tổn thương gan nhẹ hơn so với nhóm chuột gây tổn thương gan bằng PAR (Bảng 3.24 và 3.25).
Tác dụng bảo vệ gan của tầm gửi Macrosolen tricolor (Lec.) Danser
ký sinh trên cây Na cũng phù hợp với những kết quả của một số loài tầm gửi
khác thuộc chi Macrosolen ký sinh trên các cây chủ khác như:
Adam Hermawan và cs. (2011) [45] đánh giá tác dụng bảo vệ gan của
dịch chiết nước lá Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Van Tiegh. (MCE)
trên tế bào gan chuột dòng Balb/c gây ung thư gan thực nghiệm bằng 7, 12- dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) trong 15 tuần thấy tỷ lệ sống sót ở tuần thứ 8 của nhóm chuột uống DMBA + MCE 750 mg/kg chuột cao hơn so với nhóm uống DMBA 20 mg /kg (chứng dương). Nhưng xét nghiệm mô bệnh học của gan thấy hình ảnh đại thể và vi thể của các nhóm chuột uống DMPA cũng như uống DMBA + MCE không có sự khác biệt. Các tác giả cho rằng
dịch chiết Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Van Tiegh. có thể cải thiện
chức năng gan nhưng không bảo vệ được gan tránh khỏi ung thư.
Chất gây hại cho tế bào gan chủ yếu do sự peroxid hoá lipid và những thương tổn do stress oxy hóa. Do vậy, các chất chống oxy hoá có khả năng ngăn chặn sự peroxid hoá lipid nên nó là nhân tố ngăn ngừa một số bệnh, trong đó có các bệnh về gan. Do vậy, cùng với tác dụng chống oxy hóa, các dịch chiết của tầm gửi còn có tác dụng làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan [24], [45].
4.3.2.3. Về tác dụng chống viêm
Để góp phần giải thích kinh nghiệm của nhân dân sử dụng tầm gửi chữa đau nhức xương khớp, luận án đã tiến hành thử tác dụng chống viêm cấp
của dịch chiết nước tầm gửi ký sinh trên cây Gạo (Taxillus chinensis) và tầm gửi ký sinh trên cây Na (Macrosolen tricolor) trên mô hình gây phù chân
chuột cống trắng bằng carrageenin theo phương pháp của Winter và gây viêm màng bụng chuột cống trắng bằng carrageenin + formaldehyd theo phương pháp của A.R.Weidhase và R.Chelmann và thử tác dụng chống viêm mạn
theo phương pháp cấy sợi amiant đã tiệt trùng tẩm carrageenin 1% ở da gáy