Trong dân gian còn nhiều bài thuốc nghiệm phương chứa vị tầm gửi dùng để điều trị tăng huyết áp, rối loạn cholesterol máu, xơ vữa động mạch vành, viêm cầu thận mạn tính, liệt nửa người, hôn mê, tai biến mạch máu não, liệt dây thần kinh, đau dạ dày, viêm khớp dạng thấp, thấp khớp mạn tính, đau lưng, chân tay tê bại, tắc sữa, ho, suy nhược thần kinh, động thai, hội chứng Mernie… [32], [43].
(1) Điều trị tăng huyết áp:
Tang ký sinh: 16g Mã đề: 12g Chi tử: 12g Xuyên khung: 8g Câu đằng: 12g Trạch tả: 8g.
Ngưu tất: 12g Ý dĩ: 12g
Hoặc:
Tang ký sinh: 20g Địa long: 8g Hạ khô thảo: 12g
Ngưu tất: 12g Rau má: 20g Tâm sen: 8g
Rễ cỏ tranh: 20g.
- Cách dùng: sắc lấy nước, uống mỗi ngày một thang. - Chủ trị: giãn mạch, điều trị tăng huyết áp.
(2) Chữa thấp khớp mạn tính:
Tang ký sinh: 12g Đẳng sâm: 20g Độc hoạt: 12g
Hoài sơn: 16g U chạc chìu: 12g Đỗ trọng: 12g
Kê huyết đằng: 12g Đan sâm: 12g Nhục quế: 12g
Thục địa: 12g Xích thược: 12g Khương hoạt: 12g
Thổ phục linh: 12g Thiên niên kiện: 12g Ngưu tất: 10g - Cách dùng: Sắc lấy nước uống mỗi ngày một thang.
- Chủ trị: Thuốc có tác dụng chữa thấp khớp mạn tính, đau nhức xương.
(3) Chữa chân tay tê bại, tắc sữa:
Tang ký sinh: 30g Ngưu tất: 12g - Cách dùng: Sắc lấy nước uống mỗi ngày một thang. - Chủ trị: Dùng để điều trị khi bị chân tay co cứng tê bại.
(4) Chữa suy nhược thần kinh:
Tang ký sinh: 12g Thục địa: 12g Thỏ ty tử: 8g
Hoài sơn: 12g Hà thủ ô: 12g Đương quy: 8g
Kim anh: 12g Liên nhục: 12g Ngưu tất: 8g
- Cách dùng: Sắc lấy nước uống mỗi ngày một thang. - Chủ trị: chữa suy nhược cơ thể, thần kinh bị suy nhược.
(5) Chữa vết thương:
Tầm gửi cây khế, phối hợp với nước vo gạo giã nát đắp lên vết thương làm cho xương bị gãy mau lành.
Chương 2
NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
- Tầm gửi ký sinh trên cây Gạo thu hái vào tháng 5- 7 các năm 2007- 2008- 2009 tại Tam Nông (Phú Thọ).
- Tầm gửi ký sinh trên cây Na thu hái vào tháng 7 năm 2008, 2009 ở Kim Bôi (Hòa Bình).
Các tiêu bản được lưu giữ tại Bảo tàng thực vật – Khoa sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội, Phòng tiêu bản quốc gia Việt Nam, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam (VHLKHCNVN), Phòng tiêu bản bộ môn thực vật trường Đại học Dược – Hà Nội.
- Nguyên liệu sau khi thu hái được cắt thành đoạn ngắn, phơi và sấy dưới 50°C tới khô, bảo quản trong túi PE và bao bì kín, khi chiết xuất được tán thành bột thô.
Dịch chiết dùng trong nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học: Dược liệu được sắc với nước 3 lần rồi đem cô thành dạng cao đậm đặc (tỷ lệ 3:1). Khi sử dụng được cô đặc thêm hoặc pha loãng với nước cất tùy theo yêu cầu thí nghiệm và được tính ra liều tương đương với số gam dược liệu.
2.1.2. Hóa chất
- Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam IV (methanol, ethanol, n-butanol, ethylacetat, cloroform, n-hexan…).
- Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX – Diagnostics.
- Kít định lượng các enzym và chất chuyển hóa trong máu: AST, ALT của hãng Dialab GmbH (Áo).
- Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu tác dụng sinh học: + Paracetamol (Trung Quốc)
+ Silymarin (biệt dược Legalon) dạng viên nén, hàm lượng 70 mg của hãng Madaus (Korea).
+ Aspirin (biệt dược Aspegic) dạng gói bột, hàm lượng 100 mg của hãng Sanofi synthelabo Việt Nam.
+ Prednisolon dạng viên nén 5 mg.
+ Carrageenin (Carrageenan sodium salt, a naturally occurring polysaccharide) của hãng BHD Chemicals Ltd Poolo England, lọ 250 gam.
+ Amiant 6 ± 1 mg vê tròn. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Điểm chảy đo trên máy Kofler micro-hotstage, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, VHLKHCNVN.
- Phổ hồng ngoại đo trên máy Impact 410 Nicolet tại Viện Hóa học, VHLKHCNVN dưới dạng viên nén KBr.
- Phổ khối lượng ghi trên máy AGILENT 1100 LC – MSD Trap của Viện Hóa học, VHLKHCNVN dạng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS).
- Phổ khối lượng phân giải cao HR- ESI- MS được đo tại Phòng cấu trúc, Viện Hóa học, VHLKHCNVN.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ghi trên máy Bruker Avance AM500 FT- NMR tại Viện Hóa học, VHLKHCNVN, Chất chuẩn nội là tetramethyl silan.
- Xét nghiệm hằng số sinh hóa trên máy xét nghiệm sinh hóa Screen – Master của hãng Hospitex Diagnostic, Italy.
- Máy định lượng ELISA Lx800 (Mỹ).
- Kính hiển vi điện tử OLYMPUS CX41RF đọc vi thể gan.
- Đo độ phù chân chuột bằng máy Plethysmometer No 7250 của hãng Ugo – Basile (Italy).
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 18-22g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
- Chuột cống trắng chủng Wistar, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 180 ± 20g do Học viện Quân y cung cấp.
- Động vật được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước uống tự do tại Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và quan sát đặc điểm cấu tạo hoa, quả dưới kính lúp và chụp ảnh.
- Thu hái mẫu có hoa, quả làm tiêu bản mẫu cây khô. Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, phân tích hoa theo tài liệu:
+ Bài giảng thực vật (1991) [14].
+ Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc Việt Nam [13]. + Thực tập hình thái và vi phẫu thực vật [28].
- Xác định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp so sánh đặc điểm hình thái đối chiếu với khóa phân loại chi và loài trong các bộ thực vật chí và sách về thực vật [3], [5], [12], [22], [23], [98], [122].
Tiêu bản mẫu nghiên cứu được đối chiếu với các tiêu bản lưu giữ tại phòng Bách thảo thực vật – Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Sinh
thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam… cùng với sự giúp đỡ của các chuyên gia phân loại thực vật.
- Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: cắt, nhuộm kép, làm tiêu bản vi phẫu lá, thân; soi bột lá, thân, quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản các mẫu nghiên cứu dưới kính hiển vi… theo các tài liệu:
+ Thực tập hình thái và vi phẫu thực vật [28].
+ Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi [39]. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu theo tài liệu: + Bài giảng dược liệu, Tập I, II [29], [41].
+ Thực tập dược liệu phần hoá học [30].
+ Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc [18]. - Tiến hành với 2 phần dược liệu riêng: lá và thân. - Các nhóm chất hữu cơ được định tính bao gồm:
+ Định tính alcaloid: phản ứng (p/ư) với thuốc thử Mayer; thuốc thử Dragendorff và thuốc thử Bouchardat.
+ Định tính flavonoid: p/ư Cyanidin, p/ư với NaOH, p/ư với FeCl3 và p/ư Diazo hoá.
+ Định tính saponin: hiện tượng tạo bọt và p/ư phân biệt 2 loại Saponin. + Định tính Anthranoid: phản ứng Borntraeger và vi thăng hoa.
+ Định tính glycosid tim: p/ư Lieberman, p/ư Baljet và p/ư Legal: + Định tính coumarin: p/ư mở đóng vòng lacton và p/ư Diazo.
+ Định tính tanin: p/ư với FeCl3, p/ư với dung dịch gelatin 1% và p/ư với chì acetat:
+ Định tính chất béo: vết mờ trên giấy lọc. + Định tính steroid: p/ư Libermann
+ Định tính caroten: p/ư với H2SO4 đặc.
+ Định tính acid hữu cơ: p/ư với tinh thể Na2CO3. + Định tính acid amin: p/ư với thuốc thử Ninhydrin 3%. + Định tính đường khử: p/ư với thuốc thử Fehling. + Định tính polysaccharid: p/ư với thuốc thử Lugol.
2.3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
SKLM được thực hiện trên bản mỏng DC-Alufolien 60GF254 tráng sẵn (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm và hiện màu bằng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% /ethanol sấy nóng cho đến khi hiện màu.
Bảng 2.1. Các hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng
Hệ dung môi Tỷ lệ
Hệ I: Ethylacetat: Cloroform: Acid formic [4:1:1]
Hệ II: Ethylacetat: Acid formic: H2O [8:1:1]
Hệ III: Cloroform: Methanol [9:1]
Hệ IV: n- Butanol: Acid acetic: H2O [4:1:2,5]
Hệ V: Toluen: Ethylacetic: Acid formic: H2O [6:5:1,5:1]
Hệ VI: Toluen: Ethylacetat: Acid formic [5:6:1,5]
Hệ VII: Toluen: Ethylacetat: Acid formic [4:6:1]
2.3.2.3. Định lượng các chất trong phân đoạn ethylacetat
Định lượng các chất trong phân đoạn ethylacetat theo phương pháp cân [41].
Cân chính xác khoảng 25g bột dược liệu đã xác định độ ẩm. Chiết bằng methanol trong Soxhlet đến khi dịch chiết trong suốt. Cất thu hồi dung môi và cô đến cắn. Hoà tan cắn trong nước nóng 3 lần (lần 1: 20ml, lần 2:10ml, lần 3:10ml) và đun cách thuỷ 20 phút, lọc nóng lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc với n-Hexan đến khi lớp n-Hexan hết màu vàng. Tiếp tục lắc dịch chiết nước với ethylacetat đến khi lớp ethylacetat hết màu. Gộp dịch chiết ethylacetat, cất thu hồi dung môi. Đổ dịch chiết ethylacetat đậm đặc vào cốc sạch đã được xác định khối lượng trước. Cho bay hơi hết dung môi và sấy cắn ethylacetat ở 700 đến khối lượng không đổi. Cân và tính hàm lượng các chất theo công thức sau: 100 x %) h % 100 ( A a Ftp Trong đó:
- Ftp: Hàm lượng các chất trong phân đoạn chiết ethylacetat (%). - a: Khối lượng cắn thu được (g).
- A: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g). - h: Độ ẩm dược liệu (%).
2.3.2.4. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo và cây Na * Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo: * Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo:
Bột thô tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis L.) (2kg) được ngâm chiết
ở nhiệt độ phòng với ethanol 70% 3 lần. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn (14g). Bổ sung nước vào cắn, lắc đều rồi lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 1000ml. Tách lấy riêng lớp cloroform (dịch chiết A), lớp nước (dịch chiết B). Dịch chiết A đem cất thu hồi dung môi được cắn (9,1g), cắn thu được đem phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient cloroform – methanol (từ 100:1 đến 0:100) thu được các phân đoạn, cho bốc hơi dung môi thu được cắn tương ứng TG-C-1 (2,3g), TG-C-2 (0,9g), TG-C-3 (0,8g), TG-C-4 (4,7g). Sau khi kiểm tra bằng SKLM:
- Cắn TG-C-2 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-Hexan – Ethylacetat [14:1] và hệ dung môi cloroform – aceton [150:1] thu được hợp chất ký hiệu TGGT7 (15mg) và hợp chất ký hiệu TGGT8 (10mg) dạng bột màu trắng.
- Cắn phân đoạn TG-C-3 (0,8g) được phân tách trên cột silicagel pha đảo YMC – RP – 18, rửa giải bằng hệ dung môi aceton – H2O [1:5] thu được hợp chất ký hiệu TGGT9 (13mg) và hợp chất TGGT10 (17mg) dạng tinh thể màu trắng.
- Cắn TG-C-4 (4,7g) được phân tách trên cột sắc ký pha đảo YMC-RP- 18, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – aceton [8:1] thu được hợp chất TGGT12 (13mg) và TGGT13 (15mg).
Phần dịch chiết nước (dịch chiết B) được cô tới cắn rồi tiến hành sắc ký trên cột Dianion, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – H2O gradient từ 0:100 đến 100:0 thu được 2 phân đoạn TG-W-1 (2,1g) và TG-W-2 (2,5g).
- Phân đoạn TG-W-1 được tiến hành phân tách trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi cloroform – methanol [10:1] thu được 2 hợp chất TGGT1 (100mg) và TGGT2 (20mg) dạng tinh thể hình kim màu vàng đặc trưng của hợp chất Flavonoid.
- Phân đoạn TG-W-2 được phân tách trên cột sắc ký pha đảo YMC-RP- 18, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – H2O [1:1] thu được 2 hợp chất TGGT3 (19mg) và TGGT5 (13mg) màu vàng chanh.
* Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Na
Bột khô tầm gửi cây Na (2,0) kg ngâm chiết với methanol 3 lần ở nhiệt độ phòng, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn (10g). Bổ sung nước vào cắn, lắc đều rồi lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 1000ml, gộp dịch chiết cloroform, cất thu hồi dung môi, cắn cloroform được phân tách qua cột sắc kí silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient n-
hexan-ethylacetat [20:1 →5:1] thu được 2 phân đoạn MT1A và MT1B. Bốc hơi dung môi thu được cắn tương ứng MT1A(4g) và MT1B(1g).
- Cắn MT1A tiếp tục phân tách trên cột sắc kí silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-aceton [22:1], thu được 3 phân đoạn MT2A (2g), MT2B (0,3g), MT2C (0,8g). Sau khi kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng.
+ Phân đoạn MT2B được phân lập trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-ethylacetat [24:1] thu được hợp chất MT4A (10mg).
+ Phân đoạn MT2C sau khi bốc hơi dung môi, rửa cắn nhiều lần bằng aceton rồi kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được hợp chất sạch kí hiệu MT2E1 (20mg) dạng bột màu trắng.
- Cắn MT1B phân lập qua cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n- hexan-ehthylacetat [5:1] thu được hợp chất MT5C1 (10mg) dạng bột màu trắng.
Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo và cây Na được tóm tắt ở hình 2.1 và 2.2.
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các chất trong tầm gửi cây Gạo
TG-C-1 (2,3g) TG-C-2 (0,9g) TG-W-1 (2,1g) TG-C-4 (4,7g) TG-C-3 (0,8g) Bột tầm gửi Gạo (2kg) Dịch chiết EtOH thu hồi
Cắn (14g) Lớp CHCl3 Lớp nước CHCl3 thu hồi Cắn (9,1 g) Cắn (4,8g) SKC SKC SKC SKC SKC SKC TGGT7 (15mg) TGGT8 (10mg) TGGT12 (13mg) TGGT13 (15mg) TGGT10 (17mg) TGGT9 (13mg) TGGT1 (100mg) TGGT2 (20mg) TG-W-2 (2,5g) SKC TGGT5 (13mg) TGGT3 (19mg) + EtOH + H2O Lắc với CHCl3 3 lần
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất trong tầm gửi cây Na MT2A (2,0g) MT2B (0,3g) MT2C (0,8g) SKC MT4A (10mg) Kết tinh, lọc, rửa, kết tinh lại
MT2E1 (20mg) MT5C1 (10 mg) CHCl3 thu hồi Thu MT1A (4g) MT1B (1g) SKC Bột tầm gửi Na (2,0 kg) Dịch chiết MeOH MeOH thu hồi
Cắn CHCl3 SKC Cắn MT (10g) Bổ sung H2O Lắc với CHCl3 SKC MT2A (2,0g) MT2B (0,3g) MT2C (0,8g) SKC MT4A (10mg) Kết tinh, lọc, rửa, kết tinh lại
MT2E1 (20mg) MT5C1 (10 mg) CHCl3 thu hồi Thu MT1A (4g) MT1B (1g) SKC Bột tầm gửi Na (2,0 kg) Dịch chiết MeOH MeOH thu hồi
Cắn CHCl3 SKC Cắn MT (10g) Bổ sung H2O Lắc với CHCl3 SKC + MeOH
2.3.2.5. Nhận dạng các chất phân lập được từ tầm gửi cây Gạo và cây Na
- Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào độ chảy và số liệu của phổ MS, NMR 1 chiều và 2 chiều, đối chiếu với các tài liệu đã công bố.
2.3.3. Phương pháp xác định độc tính cấp
Độc tính cấp, LD50 được xác định trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfied - Wilcoxon [7], [78].
Chuột nhắt trắng nhịn đói 12 giờ, chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con. Chuột được uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na theo liều tăng dần, liều tối đa chuột có thể dung nạp được là: uống cao đặc nhất, với thể tích nhiều nhất 0,25ml/10g, 3 lần trong 24 giờ, khoảng cách giữa các lần ít nhất 2 giờ. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ.
Xác định được liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết 100% số chuột và tỷ lệ chuột chết ở các lô để xác định LD50 của tầm gửi cây Gạo và cây Na (tính LD50 theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon) [78].
Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7