Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của các dòng tế bào (Cell survival: CS) được trình bày ở bảng 3.31.
Bảng 3.31. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất ở tầm gửi cây Gạo
TT Ký hiệu mẫu
Dòng tế bào Cell survival (%)
Kết luận Hep-G2 Lu RD 1 DMSO 100,00,0 100,00,0 100,00,0 Âm tính 2 Chứng (+) 0,50,01 2,10,4 0,70,05 Dương tính 3 TGGT1 99,80,2 93,60,3 100,00,0 Âm tính 4 TGGT3 100,00,0 98,20,8 99,70,5 Âm tính 6 TGGT5 99,20,9 100,00,0 99,50,09 Âm tính 7 TGGT7 100,00,0 98,90,7 100,00,0 Âm tính
Kết quả ở bảng 3.31 cho thấy các hợp chất TGGT1 (Quercitrin), TGGT3 (Catechin), TGGT5 (Quercituron) và TGGT7: (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E) 25-trien-3β-ol phân lập từ tầm gửi cây Gạo đều không có hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào thử nghiệm.
Chương 4 BÀN LUẬN 4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
Hệ thống phân loại thực vật dùng để phục vụ cho công tác phân loại. Từ khi ra đời cho đến nay đã có rất nhiều hệ thống phân loại thực vật khác nhau như Jussieu (De Candolle (1862 - 1886), Bentham and Hooker (1880), Hallier (1903), Wettstein (1911), Kuznetsov (1914), Engler (1936), Bessey (1915), Gobi (1916), Busch (1959), Grossheim (1945), Hutchinson (1926, 1959) và hiện nay có Cronquist (1968, 1981, 1988), Thorne (1968, 1976, 2000), Takhtajan (1959 – 1987, 1997), APG II (2003) [40], [107].
Nói đến phân loại thực vật chủ yếu là nói đến thực vật có hoa bởi đây là nhóm thực vật thịnh hành trên trái đất và là nhóm sinh vật có ý nghĩa quyết định sự sống còn của các sinh vật khác trên hành tinh trong đó có con người. Các hệ thống phân loại thực vật tiếp tục được cải tiến vì được bổ sung nhiều dẫn liệu cổ thực vật, sinh hóa, di truyền, siêu cấu trúc…
Hiện nay, có ba hệ thống phân loại thực vật chính được sử dụng là hệ thống phân loại của Robert Thorne (nhà phân loại thực vật người Mỹ), công bố năm 1968 và trình bày chi tiết hơn vào năm 1976; phân loại của Armen Takhtajan (nhà thực vật Nga: 1969, 1970, 1987, 1989, 1997); Arthur Cronquist (1968) (nhà thực vật người Mỹ). Ba hệ thống này đều dựa trên hệ thống Bessey và hệ thống truyền thống trên nguyên tắc tiến hóa với những thông tin hiện đại nhất.
Trong phần tổng quan về phân loại các chi trong họ Tầm gửi (Loranthaceae), có nhiều tác giả như Lecomte [122], Phạm Hoàng Hộ [22],
Đường Hồng Dật [16]… đã xếp chi Viscum, Ginalloa và Korthalsella vào họ
Loranthaceae, còn theo Takhtajan A. (1997) đã tách 3 chi này xếp vào họ Viscaceae (tầm gửi dẹt). Sự phân loại của Takhtajan hợp lý hơn, do đó trong
phần tổng quan về thành phần hóa học các cây trong họ Loranthaceae đã không đề cập đến thành phần hóa học của các cây trong 3 chi đó.
Để thẩm định tên khoa học các mẫu tầm gửi cây Gạo và cây Na nghiên cứu các khóa phân loại của Phạm Hoàng Hộ (2000) [22] và Qiu Huaxing (2003) [98] (phụ lục 1.1 và 1.2) đã được sử dụng.
* Tầm gửi cây Gạo:
Mẫu tầm gửi cây Gạo nghiên cứu đã đối chiếu với mẫu lưu ở Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Bách thảo thực vật trường Đại học Khoa học tự
nhiên Hà Nội và đối chiếu với khóa phân loại của chi Taxillus (bảng 4.1). Bảng 4.1. Khóa phân loại của chi Taxillus
1b. Tràng hoa có lông, đôi khi lông dày đặc; lá đối xứng hoặc gần đối xứng, hiếm khi so le, không thành chùm
5b. Tràng hoa 1.2 - 3.5 cm.
7b. Lá ± nhẵn; tràng hoa [hầu hết] có lông hình sao. 12b. Tràng hoa 2- 3.5 cm.
14b. Chồi trưởng thành nở rộng, hình trứng, elip đến gần tròn. 15a. Cuống 6-7 mm; lông thường nâu đỏ
………...14. T. chinensis
Mẫu nghiên cứu cũng được GS. TSKH. Nguyễn Nghĩa Thìn, định tên
khoa học là Taxillus chinensis (DC.) Dans., thuộc họ Loranthaceae.
* Tầm gửi cây Na:
Mẫu tầm gửi cây Na nghiên cứu được đối chiếu với khóa phân
loại của chi Macrosolen (bảng 4.2).
Bảng 4.2. Khóa phân loại của chi Macrosolen
Mẫu thu thập đã được PGS. TS. Vũ Xuân Phương, Ths. Nguyễn Thế Cường Viện Sinh thái và Tài nguyên Thực vật; TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là:
Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser, Loranthaceae.
Hai loài tầm gửi nghiên cứu đã được lấy mẫu, chụp ảnh mẫu và mô tả chi tiết đặc điểm nụ, hoa, quả góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu cho phân loại.
Ngoài ra, trong luận án còn mô tả đặc điểm vi phẫu lá và thân; đặc điểm bột lá và thân để góp phần nhận biết và tiêu chuẩn hóa dược liệu 2 loài
Taxillus chinensis và Macrosolen tricolor.
4.2. VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 4.2.1. Về kết quả định tính 4.2.1. Về kết quả định tính
Kết quả định tính cho thấy:
- Trong tầm gửi Taxillus chinensis sống kí sinh trên cây Gạo có:
flavonoid, tanin, coumarin, saponin, acid hữu cơ, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid.
- Trong tầm gửi Macrosolen tricolor sống kí sinh trên cây Na có
flavonoid, tanin, coumarin, saponin, chất béo, đường khử, steroid, polysaccharid, caroten.
Kết quả nghiên cứu trong luận án cũng tương tự như kết quả định tính
của một số tác giả nghiên cứu loài T. chinensis kí sinh trên cây Quất hồng bì [38], loài M. tricolor kí sinh trên cây Nhãn [25], loài M.cochinchinensis kí
sinh trên cây Mít [34], [44]. Tuy nhiên kết quả định tính các nhóm chất cũng có liên quan đến thành phần hóa học trong cây chủ, ví dụ như Nguyễn Thị
Mai Hương [26] định tính loài T.chinensis kí sinh trên cây Trúc đào phát hiện
phản ứng glycosid tim dương tính.
Nhiều tài liệu đều cho rằng flavonoid là thành phần chính trong các loài tầm gửi [32], [36], [42], [43], [73], [108],… Trong luận án xác định hàm lượng các chất chiết được trong dung môi ethylacetat vì dùng ethylacetat không chỉ chiết được flavonoid mà còn có một số nhóm chất khác có trong tầm gửi như coumarin, polyphenol,…
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng các chất trong phân đoạn chiết
bằng ethylacetat của tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis) đạt 0,9527%. Hàm
lượng các chất trong phân đoạn chiết bằng ethylacetat của tầm gửi cây Na
(Macrosolen tricolor) là 0,3589%. Qua đó cho thấy hàm lượng các chất tan trong ethylacetat (flavonoid, polyphenol, coumarin,…) ở loài Taxillus
chinensis kí sinh trên cây Gạo gấp 2,65 lần loài Macrosolen tricolor kí sinh
trên Na. Sự khác biệt này là do 2 loài tầm gửi khác nhau và cũng có thể còn do 2 cây chủ khác nhau. Điều đó cũng phù hợp với nhận xét của nhiều tác giả cho rằng hàm lượng các chất trong tầm gửi còn phụ thuộc vào cây chủ.
4.2.3. Về kết quả phân lập các hợp chất
Từ loài Taxillus chinensis (DC.) Dans., kí sinh trên cây Gạo đã phân
lập được 10 hợp chất TGGT1, TGGT2, TGGT3, TGGT5, TGGT7, TGGT8,
TGGT9, TGGT10, TGGT12, TGGT13. Từ loài Macrosolen tricolor
(Lecomte) Danser. kí sinh trên cây Na đã phân lập được 3 chất ký hiệu MT4A, MT2E1, MT5C1. Cấu trúc hóa học của 13 hợp chất được trình bày ở hình 4.1. O O O HO OH OH O OH CH3 OH OH OH 2 4 5 7 9 1' 3' 1'' 5'' 3" 5' 10 6" O O O OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 3' 5' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O CH3 OH OH OH
Catechin (TGGT3) Quercituron (Miquelianin) (TGGT5) HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 HO 17 18 19 20 22 5 24 26 27 28 29 3 (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E), 25- trien-3β-ol (TGGT7) β-sitosterol (TGGT8) OH 1 3 5 7 9 11 13 16 18 19 20 17 trans-phytol (TGGT9) O O OH 1 2 3 4 5 6 1' 3' 5' 7' 9' 11' 13' 15' α-tocopherolquinon (TGGT10)
Glycerol-1-(6,9,12- hexadecatrienoat)-2- (8,11,14-octadecatrienoat)- 3-O-β- D-galactopyranosid (TGGT12)
Glycerol-1-(9-hexadecanenoat)-2-(9,12-octadecadienoat)-3-O-β-D- galactopyranosid (TGGT13)
20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7β, 15α-diol (MT5C1) (mới)
3β-Hydroxylup-20(29)-ene (Lupeol) (MT2E1)
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 13 hợp chất
Trong 13 hợp chất đã phân lập được từ 2 loài Taxillus chinensis (DC.) Dans. và Macrosolen tricolor (L.) Dans. có 3 hợp chất thuộc nhóm flavonoid,
1 hợp chất thuộc cấu trúc tanin, 2 hợp chất thuộc nhóm sterol, 3 hợp chất có cấu trúc triterpen 5 vòng, 3 hợp chất có cấu trúc mạch thẳng, 1 hợp chất thuộc nhóm quinon.
Trong số những hợp chất này có hợp chất mới lần đầu tiên tìm thấy trong thiên nhiên là: 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7α-ol (MT4A) và hợp
chất 20(29)-lupene-3β-nonandecanoyl-7β, 15α-diol (MT5C1). Sở dĩ được xác định là hợp chất mới do căn cứ vào các tài liệu đã tham khảo và tra cứu trong Dictionary of Natural Products on DVD (1982-2009) [57] và trên mạng internet.
2 hợp chất là glycerol - 1 - (6,9,12 - hexadecatrienoat) - 2 - (8,11,14 - octadecatrienoat) - 3 - O - β - D - galactopyranosid (TGGT12) và glycerol -1- (9-hexadecanenoat)-2-(9,12-octadecadienoat)-3-O-β-D-galactopyranosid (TGGT13) cũng chưa tìm thấy tài liệu nào trong nước và trên thế giới công bố có trong thực vật.
4 hợp chất lần đầu tiên công bố phân lập được từ chi Taxillus là:
Quercituron (TGGT5), (24s)-24-Ethylcholesta 5,22 (E), 25-trien-3β-ol (TGGT7), trans-phytol (TGGT9), α-tocopherolquinon (TGGT10).
4 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ loài Taxillus chinensis sống ký sinh
trên cây Gạo: Quercetin (TGGT1), Afzelin (TGGT2), Catechin (TGGT3), β- sitosterol (TGGT8).
1 hợp chất lần đầu tiên công bố phân lập được từ loài Macrosolen
tricolor sống ký sinh trên cây Na là lupeol.
4.3. VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 4.3.1.Về độc tính cấp
Cho từng lô chuột nhắt uống dịch chiết tầm gửi cây Gạo, tầm gửi Na với các liều tăng dần không có các triệu chứng biểu hiện độc trên hành vi hoạt động tự nhiên, trên hô hấp và tiêu hoá và trong thí nghiệm không có chuột nào chết nên không xác định được LD50. Như vậy, gửi cây Gạo và tầm gửi cây Na có độ an toàn cao cho người sử dụng.
So sánh độc tính cấp của tầm gửi trong nghiên cứu của một số tác giả khác
Trần Thị Cẩm Thạch (2009) [38] nghiên cứu độc tính cấp của tầm gửi Taxillus
liều tăng dần từ 90g dược liệu/kg tới 270g dược liệu/kg thể trọng, không quan sát thấy biểu hiện bất thường nào ở chuột và không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ. Tiếp tục theo dõi trong 7 ngày sau uống thuốc, thấy chuột vẫn ăn uống, hoạt động, bài tiết bình thường không có biểu hiện gì đặc biệt. Vì vậy, chưa tính được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống.
Hoàng Văn Võ (2006) [44] đã cho chuột uống dịch chiết Macrosolen
cochinchinensis (Lour.) Blume ký sinh trên cây Mít với các liều tăng dần từ
tương đương 50g dược liệu/kg thể trọng chuột đến 300g dược liệu/kg thể trọng chuột vẫn không có chuột chết sau 72 giờ theo dõi. Chuột không có các triệu chứng biểu hiện độc trên hành vi hoạt động tự nhiên, trên hô hấp và tiêu hóa và không xác định được LD50 ở trên chuột nhắt trắng theo đường uống.
Qua đó cho thấy cùng loài Taxillus chinensis kí sinh trên cây Gạo và kí
sinh trên cây Quất hồng bì đều không quan sát thấy biểu hiện bất thường ở chuột thí nghiệm và không xác định được LD50. Tầm gửi Macrosolen tricolor kí sinh trên cây Na không thấy biểu hiện độc tính cấp cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Hương [26]. Không xác định được LD50
của Macrosolen tricolor kí sinh trên cây Bưởi.
Vì điều kiện kinh phí, luận án mới tiến hành thử độc tính cấp. Để kết luận độ an toàn của dược liệu, khi sử dụng cần tiếp tục thử độc tính bán trường diễn, ảnh hưởng của dược liệu tới sự sinh sản và cấu trúc nhiễm sắc thể của động vật thí nghiệm. Những nội dụng này sẽ được thực hiện sau. 4.3.2. Về tác dụng sinh học
4.3.2.1. Về tác dụng chống oxy hóa
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa bằng phương pháp khử gốc
tự do DPPH của một số hợp chất phân lập được từ Taxillus chinensis (DC.)
Dans. ký sinh trên cây Gạo cho thấy hợp chất TGGT1 (3-O-α-L- Rhamnopyranosid quercetin (Quercitrin)), TGGT3 (catechin), TGGT5:
quercituron có hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH với giá trị SC50lần lượt là 40,87; 15,74; 13,31g/ml.
Kết quả này cũng tương tự như kết quả của một số tác giả nghiên cứu
tác dụng chống oxy hóa của một số loài tầm gửi chi Taxillus như:
Deng J. S. và cs. (2011) [55] nghiên cứu nghiên cứu hoạt tính dọn gốc tự do chống oxy hóa [2,2'-azino-bis (acid 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) (ABTS) và DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)] của dịch chiết ethanol
của loài Taxillus liquidambaricola (Hayata) Hosok. thấy hoạt tính loại gốc tự
do ABTS có giá trị TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity: khả năng chống oxy hóa tương đương với khả năng chống oxy hóa của Trolox) là 1063,53 ± 6,34 μg/mg. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH có nồng độ 50% tác dụng tối đa (EC50: Effective Concentration) là 88,72± 3,57 μg/ml.
Liu C. Y. và cs. (2012) [79] đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, của dịch
chiết nước, dịch chiết ethanol của Taxillus sutchuenensis (Lec.) Dans. thông
qua tác dụng dọn gốc tự do TEAC và DPPH thấy giá trị TEAC của dịch chiết nước là 57,04 ±0,58 mM/mg. Phân đoạn ethylacetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất (130,23 ±1,07 mM/mg), tiếp đến là phân đoạn chloroform (96,77 ±1,38 mM /mg), phân đoạn nước (69,73 ±0,26 mM /mg), phân đoạn n- butanol (37,02 ±0,19 mM/mg) và phân đoạn n- hexan (11,74 ±0,43 mM/mg). Phân đoạn ethylacetat có hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao nhất với giá trị IC50 là 93,32 ± 0,94 mg/ml.
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của tầm gửi cây Gạo
(Taxillus chinensis) ở mô hình gây tăng MDA trên chuột nhiễm độc
Paracetamol cho thấy hàm lượng MDA ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo liều 30g/kg và 60g/kg trong 8 ngày trước khi gây độc đã giảm rõ rệt so với lô uống PAR (p<0,05). Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi cây Gạo
liều 30g/kg và 60 g/kg (32,21% và 21,63%) tương đương với hoạt tính chống oxy hóa của Silymarin liều 70mg/kg (21,15%).
Kết quả nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của Macrosolen tricolor
(Lec.) Danser ký sinh trên cây Na ở mô hình gây tăng MDA trên chuột nhiễm độc Paracetamol cho thấy hàm lượng MDA ở các lô chuột uống cao lỏng tầm gửi Na liều 30g/kg và 60 g/kg đều có giảm so với lô uống PAR nhưng sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi cây Na liều 30g/kg và 60 g/kg (16,35% và 15,87%) thấp hơn so với hoạt tính chống oxy hóa của Silymarin liều 70mg/kg (21,15%).
Hoạt tính chống oxy hóa của Macrosolen tricolor (Lec.) Danser ký sinh trên cây Na trong nghiên cứu tương đương với tầm gửi Macrosolen
cochinchinensis (Lour.) Blume ký sinh trên cây Mít trong nghiên cứu ở mô
hình gây tăng MDA ở gan bằng CCl4 của Hoàng Văn Võ (2006) [44] với hoạt tính chống oxy hoá là 13,59%.
Tuy nhiên, hoạt tính này thấp hơn so với chất TG2 (flavonoid toàn
phần của tầm gửi Macrosolen tricolor (Lec.) Dans. ký sinh trên cây Bưởi)
trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Hương (2002) [26]. Ở nồng độ 0,3 mg/ml có tác dụng ức chế phản ứng peroxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào gan chuột rõ rệt, hàm lượng MDA còn khoảng 56,2%. Với nồng độ TG2 từ 0,3- 0,5 mg/ml ức chế hầu như hoàn toàn phản ứng peroxy hoá lipid dịch đồng thể tế bào não chuột, hàm lượng MDA duy trì ở mức 3,79 nmol- 2,8 nmol. Chất TG2 còn có tác dụng ức chế sự hình thành gốc tự do anion superoxid O2 khá mạnh, đạt tới 49,56% ở nồng độ rất thấp 25g/ml.
Hoạt tính chống oxy hóa Macrosolen tricolor (Lec.) Danser ký sinh trên cây Na cũng thấp hơn so với các loài tầm gửi chi Macrosolen trong
Rahman M. M. và cs. (2012) [99] thấy khả năng khử gốc tự do DPPH
của tầm gửi Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Van Tiegh. tối đa là
(39,47%) ở nồng độ 500 μg/ml. Nồng độ ức chế 50% (IC50) của dịch chiết
methanol từ Macrosolen cochinchinensis (Lour.) Van Tiegh. là 599,64 µg/ml,
còn giá trị IC50 của acid ascorbic là 48,38 μg/mL.
Sodde Vijay và cs. (2011) [103] cũng thấy giá trị IC50 của dịch chiết
methanol và dịch chiết nước tầm gửi Macrosolen parasiticus (L.) Dans. là
79,67 μg/ml và 54,32 μg/ml đối với dọn gốc tự do DPPH; 50,12 μg/ml và 35,12 μg/ml đối với dọn gốc tự do superoxid; 40,08 μg/ml và 28,56 μg/ml đối với thử nghiệm giảm năng lượng tiêu thụ; 86,65 μg/ml và 83,39 μg/ml đối với thử nghiệm O-phenanthrolin; 152,53 μg/ml và 102,43 μg/ml đối với dọn gốc tự do nitric oxid. Giá trị IC50 của acid ascorbic đối với các thử nghiệm trên lần lượt là 13,15 μg/ml; 5,45 μg/ml; 9,15 μg/ml; 13,43 μg/ml và 23,87 μg/ml.
Sở dĩ tầm gửi cây Gạo có tác dụng chống oxy hóa cao là do có chứa các hợp chất: quercitrin, afzelin, catechin, quercituron, α-tocopherolquinon. Do có bản chất là polyphenol, nên các flavonoid thường có tính chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn thương do gốc tự do một cách hữu hiệu. Bên cạnh hoạt tính chống oxy hóa, flavonoid còn có khả năng ức chế một số