* Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo:
Bột thô tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis L.) (2kg) được ngâm chiết
ở nhiệt độ phòng với ethanol 70% 3 lần. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn (14g). Bổ sung nước vào cắn, lắc đều rồi lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 1000ml. Tách lấy riêng lớp cloroform (dịch chiết A), lớp nước (dịch chiết B). Dịch chiết A đem cất thu hồi dung môi được cắn (9,1g), cắn thu được đem phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient cloroform – methanol (từ 100:1 đến 0:100) thu được các phân đoạn, cho bốc hơi dung môi thu được cắn tương ứng TG-C-1 (2,3g), TG-C-2 (0,9g), TG-C-3 (0,8g), TG-C-4 (4,7g). Sau khi kiểm tra bằng SKLM:
- Cắn TG-C-2 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-Hexan – Ethylacetat [14:1] và hệ dung môi cloroform – aceton [150:1] thu được hợp chất ký hiệu TGGT7 (15mg) và hợp chất ký hiệu TGGT8 (10mg) dạng bột màu trắng.
- Cắn phân đoạn TG-C-3 (0,8g) được phân tách trên cột silicagel pha đảo YMC – RP – 18, rửa giải bằng hệ dung môi aceton – H2O [1:5] thu được hợp chất ký hiệu TGGT9 (13mg) và hợp chất TGGT10 (17mg) dạng tinh thể màu trắng.
- Cắn TG-C-4 (4,7g) được phân tách trên cột sắc ký pha đảo YMC-RP- 18, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – aceton [8:1] thu được hợp chất TGGT12 (13mg) và TGGT13 (15mg).
Phần dịch chiết nước (dịch chiết B) được cô tới cắn rồi tiến hành sắc ký trên cột Dianion, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – H2O gradient từ 0:100 đến 100:0 thu được 2 phân đoạn TG-W-1 (2,1g) và TG-W-2 (2,5g).
- Phân đoạn TG-W-1 được tiến hành phân tách trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi cloroform – methanol [10:1] thu được 2 hợp chất TGGT1 (100mg) và TGGT2 (20mg) dạng tinh thể hình kim màu vàng đặc trưng của hợp chất Flavonoid.
- Phân đoạn TG-W-2 được phân tách trên cột sắc ký pha đảo YMC-RP- 18, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – H2O [1:1] thu được 2 hợp chất TGGT3 (19mg) và TGGT5 (13mg) màu vàng chanh.
* Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Na
Bột khô tầm gửi cây Na (2,0) kg ngâm chiết với methanol 3 lần ở nhiệt độ phòng, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn (10g). Bổ sung nước vào cắn, lắc đều rồi lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 1000ml, gộp dịch chiết cloroform, cất thu hồi dung môi, cắn cloroform được phân tách qua cột sắc kí silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient n-
hexan-ethylacetat [20:1 →5:1] thu được 2 phân đoạn MT1A và MT1B. Bốc hơi dung môi thu được cắn tương ứng MT1A(4g) và MT1B(1g).
- Cắn MT1A tiếp tục phân tách trên cột sắc kí silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-aceton [22:1], thu được 3 phân đoạn MT2A (2g), MT2B (0,3g), MT2C (0,8g). Sau khi kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng.
+ Phân đoạn MT2B được phân lập trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-ethylacetat [24:1] thu được hợp chất MT4A (10mg).
+ Phân đoạn MT2C sau khi bốc hơi dung môi, rửa cắn nhiều lần bằng aceton rồi kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được hợp chất sạch kí hiệu MT2E1 (20mg) dạng bột màu trắng.
- Cắn MT1B phân lập qua cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n- hexan-ehthylacetat [5:1] thu được hợp chất MT5C1 (10mg) dạng bột màu trắng.
Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo và cây Na được tóm tắt ở hình 2.1 và 2.2.
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các chất trong tầm gửi cây Gạo
TG-C-1 (2,3g) TG-C-2 (0,9g) TG-W-1 (2,1g) TG-C-4 (4,7g) TG-C-3 (0,8g) Bột tầm gửi Gạo (2kg) Dịch chiết EtOH thu hồi
Cắn (14g) Lớp CHCl3 Lớp nước CHCl3 thu hồi Cắn (9,1 g) Cắn (4,8g) SKC SKC SKC SKC SKC SKC TGGT7 (15mg) TGGT8 (10mg) TGGT12 (13mg) TGGT13 (15mg) TGGT10 (17mg) TGGT9 (13mg) TGGT1 (100mg) TGGT2 (20mg) TG-W-2 (2,5g) SKC TGGT5 (13mg) TGGT3 (19mg) + EtOH + H2O Lắc với CHCl3 3 lần
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất trong tầm gửi cây Na MT2A (2,0g) MT2B (0,3g) MT2C (0,8g) SKC MT4A (10mg) Kết tinh, lọc, rửa, kết tinh lại
MT2E1 (20mg) MT5C1 (10 mg) CHCl3 thu hồi Thu MT1A (4g) MT1B (1g) SKC Bột tầm gửi Na (2,0 kg) Dịch chiết MeOH MeOH thu hồi
Cắn CHCl3 SKC Cắn MT (10g) Bổ sung H2O Lắc với CHCl3 SKC MT2A (2,0g) MT2B (0,3g) MT2C (0,8g) SKC MT4A (10mg) Kết tinh, lọc, rửa, kết tinh lại
MT2E1 (20mg) MT5C1 (10 mg) CHCl3 thu hồi Thu MT1A (4g) MT1B (1g) SKC Bột tầm gửi Na (2,0 kg) Dịch chiết MeOH MeOH thu hồi
Cắn CHCl3 SKC Cắn MT (10g) Bổ sung H2O Lắc với CHCl3 SKC + MeOH
2.3.2.5. Nhận dạng các chất phân lập được từ tầm gửi cây Gạo và cây Na
- Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào độ chảy và số liệu của phổ MS, NMR 1 chiều và 2 chiều, đối chiếu với các tài liệu đã công bố.
2.3.3. Phương pháp xác định độc tính cấp
Độc tính cấp, LD50 được xác định trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfied - Wilcoxon [7], [78].
Chuột nhắt trắng nhịn đói 12 giờ, chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con. Chuột được uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na theo liều tăng dần, liều tối đa chuột có thể dung nạp được là: uống cao đặc nhất, với thể tích nhiều nhất 0,25ml/10g, 3 lần trong 24 giờ, khoảng cách giữa các lần ít nhất 2 giờ. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ.
Xác định được liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết 100% số chuột và tỷ lệ chuột chết ở các lô để xác định LD50 của tầm gửi cây Gạo và cây Na (tính LD50 theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon) [78].
Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu.
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hoá của dược liệu được đánh giá thông qua phản ứng bao vây gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) [37].
Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và cs (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua
giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm.
Khả năng bẫy gốc tự do SC% (Scavenging capacity) được tính theo công thức:
SC% = [100 - x 100] ±
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducan như sau:
( xi - x )2
= n - 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC≥50%) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50.
Giá trị SC50 (g/ml):
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hoà bởi chất thử.
Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của dược liệu được thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan
Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng Paracetamol (PAR) [37].
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (lô chứng): uống nước cất, thể tích 0,2 ml/10g chuột. - Lô 2 (mô hình): uống nước cất + PAR 400mg/kg.
- Lô 3 (chứng dương): uống Silymarin liều 70mg/kg + PAR 400mg/kg.
OD thí nghiệm - OD mẫu trắng OD chứng âm tính
- Lô 4: Uống cao lỏng tầm gửi Gạo (30g dược liệu/kg) + PAR 400mg/kg - Lô 5: Uống cao lỏng tầm gửi Gạo (60g dược liệu/kg) + PAR 400mg/kg. - Lô 6: Uống cao lỏng tầm gửi Na (30g /kg) + PAR 400mg/kg.
- Lô 7: Uống cao lỏng tầm gửi Na (60g /kg) + PAR 400mg/kg.
Các lô chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8 sau khi cho chuột nhịn đói 16 giờ: lô 2, 3, 4, 5, 6 và 7 đồng loạt được uống Paracetamol liều 400mg/kg.
48 giờ sau khi gây độc, giết chuột, lấy máu động mạch cảnh ở tất cả các lô chuột làm xét nghiệm AST, ALT. Lấy gan để cân trọng lượng, quan sát đại thể, làm xét nghiệm vi thể và định lượng MDA dịch đồng thể gan.
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa trên mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol
* Phương pháp xác định hoạt độ AST, ALT:
- Hoạt độ AST, ALT huyết thanh được đo trên máy xét nghiệm sinh hóa Screen – Master của hãng Hospitex Diagnostic, Italy. Đơn vị tính là UI/l.
* Phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan:
Nguyên lý của phương pháp: MDA là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan. MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530- 532nm. Uống thuốc thử N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N3 N2 N1 Uống PAR Xét nghiệm ngày
Mức độ hấp thụ màu OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol. Hệ số sau khi dựng đường cong chuẩn là 28,2.
Tiến hành: cân 0,25g gan chuột nhắt trắng nghiền với 6ml dung dịch KCl 0,12%.
- Bước 1: 1ml dung dịch nghiền từ phủ tạng thêm vào 0,25ml acid ascorbic và 0,25ml muối Mohr.
- Bước 2: Ủ 37oC trong 30 phút lấy ra, cho thêm 0,5ml dung dịch acid tricloacetic vào các ống, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bước 3: lấy 1ml dịch nổi thêm vào 0,5ml acid thiobarbituric.
- Bước 4: đun sôi cách thủy 20 phút sau đó để lạnh ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu hồng.
- Bước 5: đo quang ở máy ELISA bước sóng 532nm.
Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi được tính theo công thức sau:
% HTCO = x 100
Trong đó:
- HTCO: Hoạt tính chống oxy hóa, tính bằng %.
- CMDA gây bệnh: nồng độ MDA ở chuột nhiễm độc Paracetamol và uống nước cất.
- CMDA thử: nồng độ MDA ở chuột nhiễm độc Paracetamol và uống tầm gửi cây Gạo hoặc cây Na.
* Xét nghiệm mô bệnh học:
Xét nghiệm mô bệnh học gan chuột được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Trường Đại học Y Hà Nội – PGS., TS. Trần Văn Hợp đọc và nhận định kết quả.
CMDA gây bệnh – CMDA thử CMDA gây bệnh
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tính và mạn tính tính
2.3.6.1. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tính
* Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tính trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin của Winter C. A. và cs. (1962) [113].
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con: - Lô 1 (đối chứng): uống nước cất, 1ml/100g.
- Lô 2 (uống Aspirin) liều 150mg/kg.
- Lô 3: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 20g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 40g dược liệu/kg. - Lô 5: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 20g dược liệu/kg. - Lô 6: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 40g dược liệu/kg.
Chuột được uống thuốc 4 ngày liên tục trước khi gây viêm. Ngày thứ 4, sau khi uống thuốc 1 giờ, gây viêm bằng cách tiêm carrageenin nồng độ 1% (pha trong nước muối sinh lý) 0,1ml/chuột vào bàn chân sau, bên phải của chuột. Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt vào các thời điểm: trước khi gây viêm (Vo); sau khi gây viêm 2 giờ (V2), 4 giờ (V4), 6 giờ (V6) và 24 giờ (V24) (hình 2.4).
Uống thuốc hoặc nước cất Gây viêm (carragenin 1%) 1 2 3 4
Ngày
2h 4h 6h 24h
Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tính trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin
Vt – V0 V0
∆Vc% – ∆Vt% ∆V0%
Kết quả tính theo công thức của Fontaine.
- Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:
Trong đó:
. Vo: thể tích chân chuột trước khi gây viêm. . Vt: thể tích chân chuột sau khi gây viêm.
- Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%)
Trong đó:
+ ΔVc% : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chứng. + ΔVt% : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô uống thuốc.
* Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tính trên mô hình gây viêm màng bụng theo phương pháp của Weidhase A .R. và Chelmann Rhirf [112].
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (đối chứng): uống nước cất, 1ml/100g.
- Lô 2 (uống aspirin) liều 150mg/kg
- Lô 3: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 20g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 40g dược liệu/kg. - Lô 5: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 20g dược liệu/kg. - Lô 6: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 40g dược liệu/kg.
Các lô chuột được uống thuốc thử hoặc nước cất với thời gian như thí nghiệm trên. Gây viêm màng bụng bằng dung dịch carrageenin 0,05g + formaldehyd 1,4 ml pha trong 100 ml nước muối sinh lý vừa đủ, với thể tích 2 ml vào khoang màng bụng trong mỗi chuột. Sau 24 giờ gây viêm, mổ ổ bụng
∆V% = x 100
chuột hút dịch rỉ viêm. Đo thể tích và đếm số lượng bạch cầu/ml dịch rỉ viêm, định lượng protein trong dịch rỉ viêm.
2.3.6.2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn tính
Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn tính trên mô hình gây u hạt thực nghiệm của Ducrot R. và cs. [37].
Chuột nhắt trắng, được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con: - Lô 1 (đối chứng): uống nước cất, thể tích 0,2 ml/10g.
- Lô 2: uống prednisolon liều 5mg/kg.
- Lô 3: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 30g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 60g dược liệu/kg. - Lô 5: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 30g dược liệu/kg. - Lô 6: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 60g dược liệu/kg.
Gây viêm mạn tính bằng cách cấy sợi amian trọng lượng 6 mg tiệt trùng (sấy 120ºC trong 1 giờ) đã được tẩm carrageenin 1%, ở da gáy của mỗi chuột.
Sau khi cấy u hạt, các chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8 tiến hành giết chuột, bóc tách khối u hạt, sấy khô ở nhiệt độ 56ºC trong 18 giờ. Cân trọng lượng u hạt sau khi đã được sấy khô. 2.3.7. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity assay) của dược liệu được đánh giá theo phương pháp của Skehan và cs. (1990) và Likhiwitayawuid và cs. (1993) [76] hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
- Các dòng tế bào: do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. + Dòng tế bào Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thư gan) + Dòng tế bào Lu (Lung cancer - Ung thư phổi)
- Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Có bổ sung L- glutamin, sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfat- Fungizon); NAA (Non-Essential Amino Acid); 10% BCS (Bovine Calf Serum). Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfosid); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamin B); Acid acetic.
- Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
- Chất chuẩn chứng dương tính: dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticin, Vinblastin hoặc Taxol pha trong DMSO.
- Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm. - Tính kết quả:
+ Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất