- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 18-22g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
- Chuột cống trắng chủng Wistar, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 180 ± 20g do Học viện Quân y cung cấp.
- Động vật được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước uống tự do tại Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và quan sát đặc điểm cấu tạo hoa, quả dưới kính lúp và chụp ảnh.
- Thu hái mẫu có hoa, quả làm tiêu bản mẫu cây khô. Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, phân tích hoa theo tài liệu:
+ Bài giảng thực vật (1991) [14].
+ Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc Việt Nam [13]. + Thực tập hình thái và vi phẫu thực vật [28].
- Xác định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp so sánh đặc điểm hình thái đối chiếu với khóa phân loại chi và loài trong các bộ thực vật chí và sách về thực vật [3], [5], [12], [22], [23], [98], [122].
Tiêu bản mẫu nghiên cứu được đối chiếu với các tiêu bản lưu giữ tại phòng Bách thảo thực vật – Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Sinh
thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam… cùng với sự giúp đỡ của các chuyên gia phân loại thực vật.
- Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: cắt, nhuộm kép, làm tiêu bản vi phẫu lá, thân; soi bột lá, thân, quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản các mẫu nghiên cứu dưới kính hiển vi… theo các tài liệu:
+ Thực tập hình thái và vi phẫu thực vật [28].
+ Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi [39]. 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu theo tài liệu: + Bài giảng dược liệu, Tập I, II [29], [41].
+ Thực tập dược liệu phần hoá học [30].
+ Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc [18]. - Tiến hành với 2 phần dược liệu riêng: lá và thân. - Các nhóm chất hữu cơ được định tính bao gồm:
+ Định tính alcaloid: phản ứng (p/ư) với thuốc thử Mayer; thuốc thử Dragendorff và thuốc thử Bouchardat.
+ Định tính flavonoid: p/ư Cyanidin, p/ư với NaOH, p/ư với FeCl3 và p/ư Diazo hoá.
+ Định tính saponin: hiện tượng tạo bọt và p/ư phân biệt 2 loại Saponin. + Định tính Anthranoid: phản ứng Borntraeger và vi thăng hoa.
+ Định tính glycosid tim: p/ư Lieberman, p/ư Baljet và p/ư Legal: + Định tính coumarin: p/ư mở đóng vòng lacton và p/ư Diazo.
+ Định tính tanin: p/ư với FeCl3, p/ư với dung dịch gelatin 1% và p/ư với chì acetat:
+ Định tính chất béo: vết mờ trên giấy lọc. + Định tính steroid: p/ư Libermann
+ Định tính caroten: p/ư với H2SO4 đặc.
+ Định tính acid hữu cơ: p/ư với tinh thể Na2CO3. + Định tính acid amin: p/ư với thuốc thử Ninhydrin 3%. + Định tính đường khử: p/ư với thuốc thử Fehling. + Định tính polysaccharid: p/ư với thuốc thử Lugol.
2.3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
SKLM được thực hiện trên bản mỏng DC-Alufolien 60GF254 tráng sẵn (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm và hiện màu bằng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% /ethanol sấy nóng cho đến khi hiện màu.
Bảng 2.1. Các hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng
Hệ dung môi Tỷ lệ
Hệ I: Ethylacetat: Cloroform: Acid formic [4:1:1]
Hệ II: Ethylacetat: Acid formic: H2O [8:1:1]
Hệ III: Cloroform: Methanol [9:1]
Hệ IV: n- Butanol: Acid acetic: H2O [4:1:2,5]
Hệ V: Toluen: Ethylacetic: Acid formic: H2O [6:5:1,5:1]
Hệ VI: Toluen: Ethylacetat: Acid formic [5:6:1,5]
Hệ VII: Toluen: Ethylacetat: Acid formic [4:6:1]
2.3.2.3. Định lượng các chất trong phân đoạn ethylacetat
Định lượng các chất trong phân đoạn ethylacetat theo phương pháp cân [41].
Cân chính xác khoảng 25g bột dược liệu đã xác định độ ẩm. Chiết bằng methanol trong Soxhlet đến khi dịch chiết trong suốt. Cất thu hồi dung môi và cô đến cắn. Hoà tan cắn trong nước nóng 3 lần (lần 1: 20ml, lần 2:10ml, lần 3:10ml) và đun cách thuỷ 20 phút, lọc nóng lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc với n-Hexan đến khi lớp n-Hexan hết màu vàng. Tiếp tục lắc dịch chiết nước với ethylacetat đến khi lớp ethylacetat hết màu. Gộp dịch chiết ethylacetat, cất thu hồi dung môi. Đổ dịch chiết ethylacetat đậm đặc vào cốc sạch đã được xác định khối lượng trước. Cho bay hơi hết dung môi và sấy cắn ethylacetat ở 700 đến khối lượng không đổi. Cân và tính hàm lượng các chất theo công thức sau: 100 x %) h % 100 ( A a Ftp Trong đó:
- Ftp: Hàm lượng các chất trong phân đoạn chiết ethylacetat (%). - a: Khối lượng cắn thu được (g).
- A: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g). - h: Độ ẩm dược liệu (%).
2.3.2.4. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo và cây Na * Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo: * Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo:
Bột thô tầm gửi cây Gạo (Taxillus chinensis L.) (2kg) được ngâm chiết
ở nhiệt độ phòng với ethanol 70% 3 lần. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn (14g). Bổ sung nước vào cắn, lắc đều rồi lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 1000ml. Tách lấy riêng lớp cloroform (dịch chiết A), lớp nước (dịch chiết B). Dịch chiết A đem cất thu hồi dung môi được cắn (9,1g), cắn thu được đem phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient cloroform – methanol (từ 100:1 đến 0:100) thu được các phân đoạn, cho bốc hơi dung môi thu được cắn tương ứng TG-C-1 (2,3g), TG-C-2 (0,9g), TG-C-3 (0,8g), TG-C-4 (4,7g). Sau khi kiểm tra bằng SKLM:
- Cắn TG-C-2 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-Hexan – Ethylacetat [14:1] và hệ dung môi cloroform – aceton [150:1] thu được hợp chất ký hiệu TGGT7 (15mg) và hợp chất ký hiệu TGGT8 (10mg) dạng bột màu trắng.
- Cắn phân đoạn TG-C-3 (0,8g) được phân tách trên cột silicagel pha đảo YMC – RP – 18, rửa giải bằng hệ dung môi aceton – H2O [1:5] thu được hợp chất ký hiệu TGGT9 (13mg) và hợp chất TGGT10 (17mg) dạng tinh thể màu trắng.
- Cắn TG-C-4 (4,7g) được phân tách trên cột sắc ký pha đảo YMC-RP- 18, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – aceton [8:1] thu được hợp chất TGGT12 (13mg) và TGGT13 (15mg).
Phần dịch chiết nước (dịch chiết B) được cô tới cắn rồi tiến hành sắc ký trên cột Dianion, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – H2O gradient từ 0:100 đến 100:0 thu được 2 phân đoạn TG-W-1 (2,1g) và TG-W-2 (2,5g).
- Phân đoạn TG-W-1 được tiến hành phân tách trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi cloroform – methanol [10:1] thu được 2 hợp chất TGGT1 (100mg) và TGGT2 (20mg) dạng tinh thể hình kim màu vàng đặc trưng của hợp chất Flavonoid.
- Phân đoạn TG-W-2 được phân tách trên cột sắc ký pha đảo YMC-RP- 18, rửa giải bằng hệ dung môi methanol – H2O [1:1] thu được 2 hợp chất TGGT3 (19mg) và TGGT5 (13mg) màu vàng chanh.
* Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Na
Bột khô tầm gửi cây Na (2,0) kg ngâm chiết với methanol 3 lần ở nhiệt độ phòng, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn (10g). Bổ sung nước vào cắn, lắc đều rồi lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 1000ml, gộp dịch chiết cloroform, cất thu hồi dung môi, cắn cloroform được phân tách qua cột sắc kí silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient n-
hexan-ethylacetat [20:1 →5:1] thu được 2 phân đoạn MT1A và MT1B. Bốc hơi dung môi thu được cắn tương ứng MT1A(4g) và MT1B(1g).
- Cắn MT1A tiếp tục phân tách trên cột sắc kí silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-aceton [22:1], thu được 3 phân đoạn MT2A (2g), MT2B (0,3g), MT2C (0,8g). Sau khi kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng.
+ Phân đoạn MT2B được phân lập trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-ethylacetat [24:1] thu được hợp chất MT4A (10mg).
+ Phân đoạn MT2C sau khi bốc hơi dung môi, rửa cắn nhiều lần bằng aceton rồi kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được hợp chất sạch kí hiệu MT2E1 (20mg) dạng bột màu trắng.
- Cắn MT1B phân lập qua cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi n- hexan-ehthylacetat [5:1] thu được hợp chất MT5C1 (10mg) dạng bột màu trắng.
Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất từ tầm gửi cây Gạo và cây Na được tóm tắt ở hình 2.1 và 2.2.
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các chất trong tầm gửi cây Gạo
TG-C-1 (2,3g) TG-C-2 (0,9g) TG-W-1 (2,1g) TG-C-4 (4,7g) TG-C-3 (0,8g) Bột tầm gửi Gạo (2kg) Dịch chiết EtOH thu hồi
Cắn (14g) Lớp CHCl3 Lớp nước CHCl3 thu hồi Cắn (9,1 g) Cắn (4,8g) SKC SKC SKC SKC SKC SKC TGGT7 (15mg) TGGT8 (10mg) TGGT12 (13mg) TGGT13 (15mg) TGGT10 (17mg) TGGT9 (13mg) TGGT1 (100mg) TGGT2 (20mg) TG-W-2 (2,5g) SKC TGGT5 (13mg) TGGT3 (19mg) + EtOH + H2O Lắc với CHCl3 3 lần
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất trong tầm gửi cây Na MT2A (2,0g) MT2B (0,3g) MT2C (0,8g) SKC MT4A (10mg) Kết tinh, lọc, rửa, kết tinh lại
MT2E1 (20mg) MT5C1 (10 mg) CHCl3 thu hồi Thu MT1A (4g) MT1B (1g) SKC Bột tầm gửi Na (2,0 kg) Dịch chiết MeOH MeOH thu hồi
Cắn CHCl3 SKC Cắn MT (10g) Bổ sung H2O Lắc với CHCl3 SKC MT2A (2,0g) MT2B (0,3g) MT2C (0,8g) SKC MT4A (10mg) Kết tinh, lọc, rửa, kết tinh lại
MT2E1 (20mg) MT5C1 (10 mg) CHCl3 thu hồi Thu MT1A (4g) MT1B (1g) SKC Bột tầm gửi Na (2,0 kg) Dịch chiết MeOH MeOH thu hồi
Cắn CHCl3 SKC Cắn MT (10g) Bổ sung H2O Lắc với CHCl3 SKC + MeOH
2.3.2.5. Nhận dạng các chất phân lập được từ tầm gửi cây Gạo và cây Na
- Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào độ chảy và số liệu của phổ MS, NMR 1 chiều và 2 chiều, đối chiếu với các tài liệu đã công bố.
2.3.3. Phương pháp xác định độc tính cấp
Độc tính cấp, LD50 được xác định trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfied - Wilcoxon [7], [78].
Chuột nhắt trắng nhịn đói 12 giờ, chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con. Chuột được uống cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na theo liều tăng dần, liều tối đa chuột có thể dung nạp được là: uống cao đặc nhất, với thể tích nhiều nhất 0,25ml/10g, 3 lần trong 24 giờ, khoảng cách giữa các lần ít nhất 2 giờ. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ.
Xác định được liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết 100% số chuột và tỷ lệ chuột chết ở các lô để xác định LD50 của tầm gửi cây Gạo và cây Na (tính LD50 theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon) [78].
Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu.
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hoá của dược liệu được đánh giá thông qua phản ứng bao vây gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) [37].
Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và cs (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua
giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm.
Khả năng bẫy gốc tự do SC% (Scavenging capacity) được tính theo công thức:
SC% = [100 - x 100] ±
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducan như sau:
( xi - x )2
= n - 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC≥50%) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50.
Giá trị SC50 (g/ml):
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hoà bởi chất thử.
Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của dược liệu được thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan
Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng tầm gửi cây Gạo và cây Na trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng Paracetamol (PAR) [37].
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (lô chứng): uống nước cất, thể tích 0,2 ml/10g chuột. - Lô 2 (mô hình): uống nước cất + PAR 400mg/kg.
- Lô 3 (chứng dương): uống Silymarin liều 70mg/kg + PAR 400mg/kg.
OD thí nghiệm - OD mẫu trắng OD chứng âm tính
- Lô 4: Uống cao lỏng tầm gửi Gạo (30g dược liệu/kg) + PAR 400mg/kg - Lô 5: Uống cao lỏng tầm gửi Gạo (60g dược liệu/kg) + PAR 400mg/kg. - Lô 6: Uống cao lỏng tầm gửi Na (30g /kg) + PAR 400mg/kg.
- Lô 7: Uống cao lỏng tầm gửi Na (60g /kg) + PAR 400mg/kg.
Các lô chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8 sau khi cho chuột nhịn đói 16 giờ: lô 2, 3, 4, 5, 6 và 7 đồng loạt được uống Paracetamol liều 400mg/kg.
48 giờ sau khi gây độc, giết chuột, lấy máu động mạch cảnh ở tất cả các lô chuột làm xét nghiệm AST, ALT. Lấy gan để cân trọng lượng, quan sát đại thể, làm xét nghiệm vi thể và định lượng MDA dịch đồng thể gan.
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa trên mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol
* Phương pháp xác định hoạt độ AST, ALT:
- Hoạt độ AST, ALT huyết thanh được đo trên máy xét nghiệm sinh hóa Screen – Master của hãng Hospitex Diagnostic, Italy. Đơn vị tính là UI/l.
* Phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan:
Nguyên lý của phương pháp: MDA là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan. MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530- 532nm. Uống thuốc thử N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N3 N2 N1 Uống PAR Xét nghiệm ngày
Mức độ hấp thụ màu OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol. Hệ số sau khi dựng đường cong chuẩn là 28,2.
Tiến hành: cân 0,25g gan chuột nhắt trắng nghiền với 6ml dung dịch KCl 0,12%.
- Bước 1: 1ml dung dịch nghiền từ phủ tạng thêm vào 0,25ml acid ascorbic và 0,25ml muối Mohr.
- Bước 2: Ủ 37oC trong 30 phút lấy ra, cho thêm 0,5ml dung dịch acid tricloacetic vào các ống, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
- Bước 3: lấy 1ml dịch nổi thêm vào 0,5ml acid thiobarbituric.
- Bước 4: đun sôi cách thủy 20 phút sau đó để lạnh ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu hồng.
- Bước 5: đo quang ở máy ELISA bước sóng 532nm.
Hoạt tính chống oxy hóa của tầm gửi được tính theo công thức sau:
% HTCO = x 100
Trong đó:
- HTCO: Hoạt tính chống oxy hóa, tính bằng %.
- CMDA gây bệnh: nồng độ MDA ở chuột nhiễm độc Paracetamol và uống nước cất.
- CMDA thử: nồng độ MDA ở chuột nhiễm độc Paracetamol và uống tầm gửi cây Gạo hoặc cây Na.
* Xét nghiệm mô bệnh học:
Xét nghiệm mô bệnh học gan chuột được thực hiện tại Bộ môn Giải