Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn tính

Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn tính trên mô hình gây u hạt thực nghiệm của Ducrot R. và cs. [37].

Chuột nhắt trắng, được chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con: - Lô 1 (đối chứng): uống nước cất, thể tích 0,2 ml/10g.

- Lô 2: uống prednisolon liều 5mg/kg.

- Lô 3: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 30g dược liệu/kg. - Lô 4: uống cao lỏng tầm gửi Gạo liều 60g dược liệu/kg. - Lô 5: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 30g dược liệu/kg. - Lô 6: uống cao lỏng tầm gửi Na liều 60g dược liệu/kg.

Gây viêm mạn tính bằng cách cấy sợi amian trọng lượng 6 mg tiệt trùng (sấy 120ºC trong 1 giờ) đã được tẩm carrageenin 1%, ở da gáy của mỗi chuột.

Sau khi cấy u hạt, các chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8 tiến hành giết chuột, bóc tách khối u hạt, sấy khô ở nhiệt độ 56ºC trong 18 giờ. Cân trọng lượng u hạt sau khi đã được sấy khô. 2.3.7. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity assay) của dược liệu được đánh giá theo phương pháp của Skehan và cs. (1990) và Likhiwitayawuid và cs. (1993) [76] hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.

- Các dòng tế bào: do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. + Dòng tế bào Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thư gan) + Dòng tế bào Lu (Lung cancer - Ung thư phổi)

- Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Có bổ sung L- glutamin, sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfat- Fungizon); NAA (Non-Essential Amino Acid); 10% BCS (Bovine Calf Serum). Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfosid); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamin B); Acid acetic.

- Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…

- Chất chuẩn chứng dương tính: dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticin, Vinblastin hoặc Taxol pha trong DMSO.

- Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm. - Tính kết quả:

+ Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chứng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo công thức:

OD (mẫu) – OD (ngày 0)

CS% = x 100

OD (DMSO) – OD (ngày 0)

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan.

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS<50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50

+ Giá trị IC50: dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gíá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.

Công thức: 1/y=a+blnX Trong đó:

. Y: nồng độ chất thử; . X: Giá trị CS (%) 2.3.8. Xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được xử lí bằng phương pháp thống kê y sinh học, sử dụng phần mềm SPSS 16.0.

+ Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M± SE).

+ So sánh 2 giá trị trung bình bằng test t - student. + So sánh các tỷ lệ bằng kiểm định χ2.

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA TẦM GỬI CÂY GẠO VÀ CÂY NA CÂY GẠO VÀ CÂY NA

3.1.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật tầm gửi cây Gạo

3.1.1.1. Mô tả hình thái cây và thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Quan sát trên thực địa và tiêu bản tầm gửi cây Gạo có đặc điểm: cây bụi, cành hơi xám, lá mọc đối, cuống 3-7cm, phiến nguyên, hình elip hoặc hình trứng, hơi dày, dài 6- 8 rộng 2,5-5 cm, gân bên có 4-6 đôi, đỉnh lá nhọn, không lông. Hoa mọc thành cụm riêng lẻ hoặc tụ 2-3 chùm ở kẽ lá, có khi mọc ở những mấu không lá, 4-8 hoa ở mỗi nhánh, đài hình trứng, tồn tại. Hoa màu vàng cam, hình ống, tràng hợp, thắt lại ở đoạn giữa, khi nở 6 thuỳ lật ra ở chỗ thắt lại. Chỉ nhị hình dùi, bao phấn 1mm. Vòi nhụy hình chỉ, liền nhau ở gốc, núm nhụy hình đầu.

Quả mọng, màu vàng cam khi chín màu đỏ, hình trứng hoặc gần hình cầu. Hoa nở vào tháng 12- 3. Cuống hoa dài 3 – 5 mm; bầu dưới hình trái xoan, màu xanh dài 2 -3 mm; có 6 tràng hàn liền tạo thành ống, màu vàng, dài 5- 9 mm. Bộ nhị có 6 nhị đính trên tràng màu đỏ thẫm, dài 2 – 4 mm.

Vòi nhị đính với bầu dài 8 – 12 mm. Bầu một ô, noãn đính trung trụ. Bao phấn 2 ô, nứt dọc, có 3 hạt, quả màu vàng hình hạt tiêu, đường kính dọc 4 – 6 mm, ngang 3- 4 mm (hình 3.1).

Tầm gửi ký sinh trên cây Gạo Cành mang hoa quả

Hoa tầm gửi Gạo Quả tầm gửi Gạo

Bao phấn (X 25 lần) Bầu cắt ngang (X 25 lần) Hình 3.1. Một số đặc điểm thực vật của tầm gửi cây Gạo

Sau khi quan sát, phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu, đối chiếu với mẫu lưu ở Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Bách thảo thực vật trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, GS. TSKH Nguyễn

Nghĩa Thìn đã định tên khoa học của tầm gửi ký sinh trên cây Gạo là Taxillus

chinensis (DC.) Dans, thuộc họ Loranthaceae.

A B

Hình 3.2. Mẫu tiêu bản lưu tại Bách thảo thực vật Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội (A) và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (B)

3.1.1.2. Đặc điểm vi phẫu lá và thân * Vi phẫu lá:

- Phần gân lá: Gân phía trên hơi lồi, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì (1) trên và dưới là một hàng tế bào hình chữ nhật nhỏ, xếp đều đặn, phía ngoài dược

phủ bởi một lớp cutin mỏng. Sát biểu bì là lớp mô dày (2), phía trên và dưới có 1-2 lớp tế bào. Mô mềm (3) cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng, hình đa giác đều hay hình trứng thuôn, có kích thước lớn; rải rác trong mô mềm có các đám tế bào mô cứng (4) thường xếp thành đám lớn, tạo thành cung rời rạc bao quanh bó libe-gỗ, tế bào mô cứng có hình dạng khác nhau, thành rất dày thường chứa tinh thể calci oxalat hình khối (9). Tinh thể calci oxalat hình khối có kích thước 17-32  14-28 m. Giữa gân lá là một bó libe-gỗ lớn, cung libe (5) phía trên và dưới tạo thành vòng cung bao quanh bó gỗ, cung libe phía dưới dày hơn cung libe phía trên, gỗ (6) cấu tạo bởi các mạch gỗ xếp thành hàng xen kẽ trong nhu mô gỗ tạo thành các bó riêng biệt.

- Phần phiến lá: biểu bì (1) trên và dưới là một hàng tế bào hình chữ nhật tương tự phần gân lá, nhưng có kích thước nhỏ hơn. Lớp tế bào mô giậu (7) quan sát không rõ. Mô mềm (8) là những tế bào có kích thước lớn, thành mỏng, rải rác có các bó libe-gỗ của gân phụ và các khuyết tế bào có kích thước lớn (hình 3.3).

* Vi phẫu thân:

Mặt cắt ngang thân có tiết diện tròn, quan sát dưới kính hiển vi từ ngoài vào trong thấy bần (2) cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào hình chữ nhật thường bị ép dẹt xếp thành hàng đồng tâm và dãy xuyên tâm, mặt ngoài phủ một lớp cutin mỏng (1), rải rác có các lỗ vỏ nhỏ. Mô mềm vỏ (3) cấu tạo bởi các tế bào hình chữ nhật hay hình trứng kích thước lớn, không đều, thành mỏng. Rải rác trong mô mềm vỏ có các đám tế bào mô cứng (4) xếp thành các đám nhỏ không đều nhau và tạo thành một vòng rời rạc. Phần libe-gỗ rất phát triển, libe-gỗ xếp thành dải thẳng có libe (5) phía ngoài, phần gỗ phía trong (7), các dải libe-gỗ bị phân cách bởi các tia ruột (6) hẹp. Tia ruột (6) cấu tạo bởi 1-2 hàng tế bào nhỏ xếp thành hàng theo hướng xuyên tâm. Trong cùng là mô mềm ruột (8) cấu tạo bởi các tế bào hình tròn hay đa giác có kích thước lớn, thành mỏng, rải rác có chứa các đám tinh thể calci oxalat hình khối (9) (hình 3.4).

3.1.1.3. Đặc điểm bột dược liệu

Bột màu vàng lục nhạt, không mùi, không vị, soi dưới kính hiển vi thấy mảnh bần (1) cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác xếp thành nhiều lớp chồng lên nhau. Mảnh biểu bì mang lỗ khí (2). Mảnh mô mềm (3) là các tế bào hình đa giác thành mỏng. Tế bào sợi (4) đứng riêng lẻ hay tụ tập thành bó. Tế bào mô cứng (8) có nhiều hình dạng khác nhau, thành dày, khoang hẹp. Mảnh mạch (9) thường thấy mạch hình mạng và mạch xoắn.

Tinh thể calci oxalat hình khối có kích thước17-32  14-28 m. Hạt phấn hoa hình ba góc (7), có đường kính 40-57 m. Lông che chở đa bào (6) hình sao (hình 3.5).

Hình 3.5. Đặc điểm bột dược liệu tầm gửi cây Gạo 3.1.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật tầm gửi cây Na

3.1.2.1. Mô tả hình thái cây và thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Quan sát trên thực địa và tiêu bản thấy: cây bụi, cành hơi xám, lá mọc đối, chéo chữ thập, cuống lá 2-3 mm, phiến lá nguyên, hình elip hoặc hình trứng, hơi dày, dài 4-5x 3-4 cm, gân bên có 2-3 đôi, gân khó nhìn ở cả hai mặt, đỉnh lá tròn. Hoa mọc thành cụm riêng lẻ hoặc tụ 2-3 chùm ở kẽ lá, có khi mọc ở những mấu không lá, cuống chung dài 1mm, cuống riêng rất

ngắn,lá bắc hình bán nguyệt, hai lá bắc con gần tròn, hàn liền. Hoa trưởng thành dài 2-3 cm, hoa mẫu 6 đối xứng hai bên, đài hình khuyên, tràng hoa ba màu: màu đỏ ở dưới, ở giữa màu xanh, đỉnh màu tím, hơi cong, ống tràng phồng, tràng hợp, thắt lại ở đoạn giữa, khi nở 6 thuỳ lật ra ở chỗ thắt lại. Chỉ nhị đính trên họng tràng, bao phấn 2-3mm. Vòi nhụy hình chỉ, liền nhau ở gốc, núm nhụy hình đầu. Quả mọng, khi non màu xanh, khi chín màu mận chín, hình cầu (hình 3.6).

Cành tầm gửi mang hoa Cành mang nụ hoa và quả

Hoa nguyên vẹn Hoa bổ dọc

Bầu bổ ngang Bầu bổ dọc

Hình 3.6. Một số đặc điểm thực vật của tầm gửi cây Na

Mẫu nghiên cứu đã được PGS. TS. Vũ Xuân Phương, Ths. Nguyễn Thế Cường Viện Sinh thái và Tài nguyên Thực vật; TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ

môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là:

Macrosolen tricolor (Lecomte) Danser, Loranthaceae.

Tiêu bản khô được lưu tại: Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP), Mã tiêu bản: HNIP/17208/10.

3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu lá và thân * Đặc điểm vi phẫu lá:

Gân phía trên hơi lồi, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì (1) trên và dưới là một hàng tế bào hình chữ nhật nhỏ, xếp đều đặn, phía ngoài phủ bởi một lớp cutin mỏng. Sát biểu bì là lớp mô dày (2), phía trên và dưới có 1-2 lớp tế bào. Mô mềm (3) cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng, hình đa giác đều hay hình trứng thuôn, kích thước lớn; rải rác trong mô mềm có các đám tế bào mô cứng (4) thường xếp thành đám lớn, tạo thành cung rời rạc bao quanh bó libe-gỗ.

Hình 3.7. Vi phẫu lá tầm gửi cây Na

Tế bào mô cứng có hình dạng khác nhau, thành rất dày. Tinh thể calci oxalat hình khối (7). Giữa gân lá là một bó libe-gỗ lớn, cung libe (5) phía trên và dưới tạo thành vòng cung bao quanh bó gỗ, cung libe phía dưới dày hơi cung libe phía trên, gỗ (6) cấu tạo bởi các mạch gỗ xếp thành hàng xen kẽ trong nhu mô gỗ tạo thành các bó riêng biệt (hình 3.7).

* Đặc điểm vi phẫu thân:

Mặt cắt ngang thân có tiết diện tròn. Nhìn dưới kính hiển vi từ ngoài vào trong thấy: Bần (2) cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào hình chữ nhật thường bị ép dẹt xếp thành hàng đồng tâm và dãy xuyên tâm, mặt ngoài có phủ một lớp cutin mỏng (1) và rải rác có các lỗ vỏ nhỏ. Mô mềm vỏ (3) cấu tạo bởi các tế bào hình chữ nhật hay hình trứng có kích thước lớn, xếp không đều, thành mỏng.

Rải rác trong mô mềm vỏ có các đám tế bào mô cứng (4) xếp thành các đám to nhỏ không đều nhau và tạo thành một vòng rời rạc. Phần libe-gỗ rất phát triển, có libe (5) phía ngoài, phần gỗ phía trong (7), các dải libe-gỗ bị phân cách bởi các tia ruột (6) hẹp. Tia ruột (6) cấu tạo bởi 1-2 hàng tế bào nhỏ xếp thành hàng theo hướng xuyên tâm. Trong cùng là mô mềm ruột (8) cấu tạo bởi các tế bào hình tròn hay đa giác có kích thước lớn, thành mỏng, rải rác có chứa các đám tinh thể calci oxalat hình khối (9) (hình 3.8).

3.1.2.3. Đặc điểm bột dược liệu

Bột màu vàng lục nhạt, không mùi, không vị, soi dưới kính hiển vi thấy mảnh bần (1) cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác xếp thành nhiều lớp chồng lên nhau. Mảnh biểu bì mang lỗ khí (2). Mảnh mô mềm (3) là các tế bào hình đa giác thành mỏng. Tế bào sợi (4) đứng riêng lẻ hay tụ tập thành bó. Mảnh mô mềm mang các tinh thể calci oxalat. Mảnh mạch (5) thường thấy mạch hình mạng và mạch xoắn. Tế bào mô cứng (6) có nhiều hình dạng khác nhau, thành dày, khoang hẹp. Tinh thể calci oxalat (7) hình khối có kích thước 17- 32  14- 28 m (hình 3.9).

Hình 3.9. Đặc điểm bột dược liệu tầm gửi cây Na

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA TẦM GỬI CÂY GẠO VÀ CÂY NA

3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học của tầm gửi cây Gạo và cây Na

Kết quả định tính các nhóm chất chính trong dược liệu tầm gửi cây Gạo và cây Na bằng phản ứng hoá học được trình bày ở bảng 3.1 và 3.2.

Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất chính trong tầm gửi cây Gạo

TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận Thân Lá Thân Lá

1 Alcaloid

P/ư với TT. Mayer - -

Không Không P/ư với TT. Dragendorff - -

P/ư với TT. Bouchardat - -

2 Flavonoid

P/ư Cyanidin +++ +++

Có Có P/ư với NaOH +++ +++

P/ư với FeCl3 5% +++ +++ P/ư với TT Diazo +++ +++

3 Saponin Hiện tượng tạo bọt - ++ Không Saponin steroid Phân biệt hai loại saponin

4 Anthranoid P/ư Borntrager - - Không Không Vi thăng hoa - - 5 Glycosid tim P/ư Lieberman ++ ++ Không Không P/ư Baljet - - P/ư Legal - -

6 Coumarin P/ư mở đóng vòng lacton ++ ++ Có Có P/ư với TT. Diazo +++ +++

7 Tanin

P/ư với TT FeCl3 5% +++ +++

Có Có P/ư với Pb(CH3COO)2 ++ ++

P/ư với dd. Gelatin 1% + +

8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc ++ ++ Có Có 9 Steroid P/ư Libermann ++ ++ Có Có 10 Caroten P/ư với H2SO4 đặc - - Không Không 11 Acid hữu cơ P/ư với bột Na2CO3 ++ ++ Có Có 12 Acid amin P/ư với TT. Ninhydrin 3% - - Không Không 13 Đường khử P/ư với TT. Fehling +++ +++ Có Có 14 Polysaccharid P/ư với TT. Lugol ++ ++ Có Có

Bảng 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất chính trong tầm gửi cây Na