Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập

2.3.4.1. Xác định serotype kháng nguyên O vi khuẩn E. coli bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

- Vật liệu dùng xác định.

Các chủng vi khuẩn E. coli được lưu giữ trên thạch máu.

Kháng huyết thanh chuẩn (nhóm đa và đơn giá), nước muối sinh lý 0,85%, phiến kính sạch.

- Vi khuẩn E. coli có nhiều serotype, vì vậy để xác định serotype vi khuẩn E. coli, tiến hành làm phản ứng với kháng huyết thanh nhóm, sau đó mới tiến hành xác định serotype với kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm kháng huyết thanh đã ngưng kết.

- Cách tiến hành như sau:

Trên một phiến kính sạch, ở hai đầu nhỏ hai giọt nước sinh lý. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định serotype mọc trên thạch Macconkey hoặc thạch máu hòa tan vào hai giọt nước muối sinh lý ở hai đầu của phiến kính.

Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy kháng huyết thanh nhóm trộn đều vào một bên huyễn dịch vi khuẩn, huyễn dịch vi khuẩn bên kia phiến kính không trộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm). Để yên từ 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, đọc kết quả phản ứng. Phản ứng dương tính khi trong giọt huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn xuất hiện những hạt ngưng kết lấm chấm. Phản ứng âm tính khi huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh vẫn đục đều không có hạt ngưng kết xuất hiện như bên đối chứng âm.

Chọn những khuẩn lạc có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiến hành làm ngưng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm như đã

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tiến hành với nhóm. Nhận xét kết quả như đối với kháng huyết thanh nhóm. Nếu một vi khuẩn ngưng kết chéo với nhiều nhóm, hoặc nhiều kháng huyết thanh đơn giá thì phải tiến hành pha loãng kháng huyết thanh thành các độ pha loãng khác nhau theo hệ số 2 (1/2, 1/4, 1/8,…1/64), rồi làm phản ứng với từng độ pha loãng.

Serotype nào ngưng kết ở hiệu giá pha loãng kháng huyết thanh cao nhất thì đó là serotype của vi khuẩn.

2.3.4.2. Xác định khả năng dung huyết của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng gây dung huyết trên thạch máu

Giống E. coli thuần khiết được ria cấy trên môi trường thạch máu, bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ.

Đánh giá kết quả:

- Dung huyết hoàn toàn (-haemolysin): Xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu to, rõ, có thể nhìn qua được môi trường.

- Dung huyết không hoàn toàn (-haemolysin): Xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu nhỏ, có ánh xanh.

- Không dung huyết (-haemolysin): Xung quanh khuẩn lạc không có vòng tan máu.

2.3.4.3. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được.

- Để xác định độc lực của các vi khuẩn gây bệnh, có thể thực hiện bằng

phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm.

- Xác định LD50 (Lethal - Dosis 50 - Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) của các vi khuẩn phân lập được.

* Phương pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm theo Carter G.R và cs, (1995) [37].

Đây là phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn gây bệnh, đồng thời thu thập được vi khuẩn thuần khiết dùng để giữ giống và đinh type vi khuẩn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Động vật thí nghiệm là chuột bạch khỏe mạnh, khối lượng 18-20 gam. Dùng canh trùng E. coli nuôi cấy ở 37oC/24 giờ hoặc huyễn dịch chế từ bệnh phẩm, hoặc từ khuẩn lạc điển hình (đem trộn với nước sinh lý 0,9% theo tỷ lệ 1/5 hoặc 1/10), tiêm vào xoang phúc mạc chuột bạch. Mỗi chủng tiêm 2 con, liều tiêm 0,2ml canh trùng/con.

Sau khi tiêm, theo dõi thời gian chuột chết trong vòng 7 ngày, sau khi chuột chết, mổ khám kiểm tra bệnh tích rồi lấy máu tim cấy vào môi trường BHI, thạch máu, thạch Macconkey để giám định lại các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. Tiếp tục giữ giống và làm kháng sinh đồ.

* Phương pháp xác định LD50 của các chủng vi khuẩn phân lập được.

Căn cứ vào số lượng vi khuẩn trong dịch canh trùng ở độ pha loãng từ 10-9

(số lượng vi khuẩn được xác định theo phương pháp đếm số khuẩn lạc của R.Kock).

Tiến hành tiêm chuột thí nghiệm, xác định số chuột chết cận trên và dưới 50% tổng số chuột được tiêm, áp dụng công thức tính của Reed-Muench để xác định LD50 của vi khuẩn cần nghiên cứu.

Công thức tính LD50:

a - 50

LgLD50 = LgA + x d a - b

Trong đó:

A: nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột. B: nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50%. a: tỷ lệ chuột chết do liều A gây ra (%). b: tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%). d: Lg của nồng độ pha loãng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.3.4.4. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp kháng sinh đồ

Chuẩn bị môi trường:

Môi trường tiêu chuẩn thạch kháng sinh, pH từ 7,2 - 7,4, được hấp ướt 1210C trong 15 phút, để nguội tới 45 - 500C rồi đổ vào đĩa Petri với lượng 20ml thạch trong một đĩa 9 cm. Các đĩa thạch này nếu không dùng ngay trong ngày thì được để trong túi ni lông nhằm tránh bốc hơi, bảo quản ở trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 - 80

C.

Các khoanh giấy tẩm kháng sinh được bảo quản trong các lọ có chất hút ẩm, giữ ở 40C. Khi dùng lấy khỏi tủ lạnh và để đạt nhiệt độ phòng trước khi mở nắp.

- Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn từ một đĩa nuôi cấy thuần chủng để mọc qua đêm, dùng que cấy vô trùng chấm vào các khuẩn lạc tương tự nhau để lấy một vòng que cấy đầy và hòa vào 1ml nước muối sinh lý, pha loãng để có độ đục của huyễn dịch tương đồng với độ đục chuẩn trong dãy so màu McFarland 0,5 (tương đương với khoảng 108

vi khuẩn/ml).

Sử dụng huyễn dịch cấy trên môi trường kháng sinh đã khô, bằng cách láng 0,5 ml canh khuẩn, sau đó hút phần hỗn dịch thừa đi (có thể sử dụng tăm bông vô trùng quét đều trên mặt thạch).

- Đặt khoanh giấy kháng sinh:

Các khoanh giấy kháng sinh được đặt một cách chắc chắn trên mặt đĩa thạch cách đều nhau khoảng 25mm. Dùng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt khoanh giấy nhẹ nhàng rồi khẽ ấn khoanh giấy xuống sao cho khoanh giấy tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Không được chuyển dịch khoanh giấy khi nó đã tiếp xúc với mặt thạch. Các đĩa được để ở nhiệt độ phòng 30 phút để cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán đều trong thạch. Lật ngược đĩa thạch, ủ 370

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.1: Bảng đánh giá kết quả đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ

TT Loại kháng sinh Lƣợng kháng sinh (g) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Kháng thuốc Mẫn cảm yếu Mẫn cảm mạnh 1 Amoxicillin 10 ≤ 15 14 - 17  18 2 Colistin 10 ≤8 9 - 10 11 3 Enrofloxacin 5 ≤ 16 17 - 22  23 4 Gentamicin 10 ≤ 12 13 - 14  15 5 Kanamycin 30 ≤13 14 - 17 18 6 Norfloxacin 10 ≤12 13 - 16 17 7 Streptomycin 10 ≤11 12 - 14 15 8 Tetracyclin 30 ≤ 14 15 - 18  19 9 Trimethoprim/ Sulfamethroxazol 25 ≤ 10 11 - 15  16 10 Ampicilin 10 ≤ 13 14 - 16  17 11 Cephalothin 30 ≤ 14 15 - 17  18 12 Doxyciline 30 ≤ 12 13 - 15  16 - Đọc kết quả:

Đường kính của vòng vô khuẩn được đo bằng thước kẹp từ phía sau mặt đĩa. Nếu cạnh của vòng vô khuẩn không rõ nét, phải đo khu vực ức chế xấp xỉ 80% vi khuẩn không mọc được. Đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng mm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli theo bảng tiêu chuẩn đánh giá kết quả của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999).

2.3.4.5. Phương pháp xác định độc tố đường ruột (Enterotoxin) bằng phương pháp khuyếch tán trong da thỏ theo Sandefur và cs (1976) [75]

- Chuẩn bị huyễn dịch độc tố: Các chủng E. coli cần xác định được nuôi cấy vào môi trường (Brain Heart Infusion - BHI), bồi dưỡng ở 370

C. Sau khi nuôi cấy được 3 giờ tiến hành bổ sung 0,5 mg Licomycin/1ml canh khuẩn, bồi dưỡng tiếp đến 24 giờ. Sau 24 giờ, canh trùng được đem ly tâm trong điều kiện lạnh, tốc độ 3.000 - 4.000 vòng/phút (30 phút), bỏ cặn và lấy dịch trong bên trên, dịch được lọc bằng giấy lọc và chia 2 phần.

+ Phần 1: Dùng xác định độc tố không chịu nhiệt được chia thành lượng nhỏ rồi bảo quản ở 40

C.

+ Phần 2: Dùng xác định độc tố chịu nhiệt được đun trong nồi đun cách thuỷ ở nhiệt độ 800C trong 30phút để vô hoạt độc tố không chịu nhiệt, rồi để nguội chia thành lượng nhỏ bảo quản ở 40

C. - Phương pháp tiến hành

+ Chọn thỏ trắng khoẻ, không mắc bệnh khối lượng khoảng 2,5 - 3,0 kg, cắt trụi sạch lông ở phần lưng hoặc dùng thuốc dụng lông bôi, sau đó dùng bút dạ chia 2 bên lưng thỏ thành những ô vuông có cạnh đều nhau 2x2cm.

+ Tại chính giữa mỗi ô, tiêm vào nội bì da thỏ 0,1ml dịch độc tố đã được chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu tiêm 2 ô cách xa nhau. Đối chứng âm được tiêm 0,1ml dung dịch BHI nguyên chất.

+ Sau 18 giờ tiêm dịch độc tố không chịu nhiệt và 2 giờ tiêm dịch độc tố chịu nhiệt, tiến hành tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ dung dịch Evans Blue liều 40mg/kg trọng lượng, sau 2 giờ đọc kết quả.

- Đánh giá kết quả: Đo điện tích biến đổi màu xanh của các ô tiêm độc tố: + Phản ứng dương tính khi vùng thẩm xuất của Evans Blue trên mỗi ô vuông có diện tích bằng hoặc lớn hơn 16mm2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

+ Phản ứng nghi ngờ khi xuất hiện vùng thẩm xuất của Evans Blue trên mỗi ô vuông nhưng có diện tích nhỏ hơn 16mm2

.

+ Phản ứng âm tính khi không xuất hiện vùng thẩm xuất của

Evans Blue trên mỗi ô vuông (giống đối chứng âm). Để xác định khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt của các chủng vi khuẩn E. coli

phân lập được, chúng tôi sử dụng phương pháp khuyếch tán trên da thỏ (Intradermal Test) theo Sanderfur và Penterson (1976) [75].

2.3.4.6. Phương pháp xác định loại độc tố VT2e và kháng nguyên F18 bằng phương pháp PCR

Có rất nhiều phương pháp có thể dùng để xác định độc tố đường ruột (Enterotoxin) và kháng nguyên bám dính (Fimbriae) của vi khuẩn E. coli. Hiện nay người ta dùng phương pháp PCR để xác định các loại độc tố và kháng nguyên bám dính, đây là phương pháp ưu việt nhất về độ nhạy và tính chính xác của nó.

* Cách tiến hành:

- DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 370

C/28h.

- Hỗn hợp phản ứng PCR:

Primers: 1 l mỗi loại Dung dịch đệm (5 X): 5,0 l

Enzyme (Taq polymerese): 0,05 l

Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25l cho 1 phản ứng. Chu trình của một phản ứng PCR (Amplification): Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer.

- Chạy điện di:

Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), được trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 3%, trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp.

Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phốt phát nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo các kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại kích thước phân tử lớn chạy chậm, loại có kích thước bé thì chuyển dịch nhanh hơn.

- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (1l/ml) trong vòng 15 phút. Để quan sát sản phẩm PCR, DNA mẫu cần phải được nhuộm bằng ethidium bromide (BEt) dưới đèn tử ngoại. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do. BEt có thể sử dụng bằng cách trộn với mẫu, cho vào đệm điện di (0,5l/ml), cho vào thạch (0,5l/ml) hoặc nhuộm sau khi điện di xong (1l/ml).

Bảng 2.2: Chu trình của phản ứng PCR

Yếu tố xác định

Chu trình

thứ nhất 30 chu trình tiếp theo

Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) VT2e 94/5 94/0,5 55/0,5 72/0,5 72/7 F18 94/5 94/0,5 50/0,5 72/0,5 72/7

- Đọc kết quả: Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camera. Trên ảnh chụp nền đen,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker) (giếng M), được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một lỗ riêng biệt, cạnh các lỗ dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR.

2.3.5. Đánh giá hiệu quả sử dụng vacxin phòng bệnh phù đầu cho lợn con từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi