2.1.2.7. Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli
phân lập.
2.1.2.8. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch.
2.1.3. Thử nghiệm phác đồ phòng và điều trị bệnh phù đầu lợn con
2.1.3.1. Kết quả thử nghiệm vacxin phòng bệnh.
2.1.3.2. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh phù đầu ở lợn con.
2.2. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Hạch màng treo ruột, dịch ruột, chất chứa ruột non, máu tim, gan, lách lấy từ những lợn bị mắc bệnh phù đầu đã xuất hiện một trong những triệu chứng sau: phù mí mắt, thần kinh (không kiểm soát được vận động ...), thay đổi tiếng kêu, chết đột ngột.
2.2.2. Các loại hóa chất môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Sử dụng một số môi trường, hóa chất do các hãng Oxoid (Anh), Merk (Pháp), Biorad… sản xuất gồm:
* Các loại môi trường.
- Thạch máu. - Thạch thường. - Thạch MacConkey. - Thạch Endo. - Thạch TSI. - Green brilliant. - Nutrient broth. - Thạch kháng sinh.
- Các loại môi trường đường: saccharose, lactose, galactose, maltose, fructose, dulcitol, manitol. Môi trường TSB.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Các loại hóa chất.
- Thuốc nhuộm Gram. - Dung dịch Kowacs. - Giấy thử kháng sinh đồ.
- Các loại kháng sinh, chế phẩm sinh học.
2.2.3. Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định type vi khuẩn E. coli phân lập được: Kháng huyết thanh chế theo quy trình của Nhật bản (JICA) và do lập được: Kháng huyết thanh chế theo quy trình của Nhật bản (JICA) và do Nhật Bản cung cấp.
Kháng huyết thanh định type kháng nguyên O đa giá và đơn giá.
2.2.4. Loại vacxin phòng bệnh phù đầu
Vacxin E. coli phù đầu lợn sản xuất tại xưởng sản xuất thí nghiệm - Viện Thú y. Tiêm dưới da cho lợn con theo mẹ. Liều tiêm: Lợn con theo mẹ từ 14-21 ngày tuổi. Liều 1ml/con.
2.2.5. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.5.1. Đối tượng
- Lợn con ở lứa tuổi từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi bị bệnh phù đầu. - Chuột nhắt trắng: Từ 18-20g/con, khoẻ mạnh.
- Thỏ khoẻ mạnh trọng lượng 2,5 - 3,0 kg.
2.2.5.2. Địa điểm nghiên cứu
- Một số các trang trại và các hộ chăn nuôi ở các huyện: Thanh Ba, Phù Ninh, Đoan Hùng thuộc tỉnh Phú Thọ.
- Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi trùng - Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục thú y, Chi cục thú y tỉnh Phú Thọ.
2.2.5.3. Thời gian nghiên cứu
- Từ năm 1/2009 đến năm 1/2010.
2.2.6. Nguyên liệu dùng cho PCR
- Các chủng vi khuẩn dùng làm đối chứng dương cho phản ứng PCR. - Các primers, hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR xác định từng yếu tố gây bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ AMP x 5 buffer.
+ Dung dịch NaCl2 stock. + dNTP stock.
+ PCR x 10 buffer.
- Các dung dịch và hóa chất cần cho chạy điện di. + 50 x TAE.
+ 0,5 M (EDTA). + Loading buffer.
- Các chủng E. coli ATTC 25922 dùng làm đối chứng dương cho phản ứng PCR. - Các primers. Các yếu tố gây bệnh Mã primer Trình tự DNA F18 FedA-1 FedA-2
5’ GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC 3’ 5’ CIT GTA AGT AAC CGC GTA AGC 3’
VT2e
VT2-Fw VT2-Rv
5’ CTT GGG TAT CCT ATT CCC GG 3’ 5’ CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC 3’
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study) dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm
(Nguyễn Như Thanh, 2001 [26], Nguyễn Văn Thiện, 1997 [28]).
2.3.1.1. Chọn mẫu điều tra
Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc. Chọn ngẫu nhiên ở mỗi huyện 3 xã, mỗi xã ngẫu nhiên chọn 3 thôn, trong thôn điều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tra các hộ chăn nuôi lợn nái sinh sản và lợn thịt (mỗi huyện có tính đại diện tương đối về tự nhiên như thời tiết, sinh thái…).
- Số huyện được điều tra: 3; số xã là: 9; số thôn, khu là: 27 - Số lần điều tra: 4 lần theo các mùa trong năm 2009. - Số lợn được điều tra: 39.420 con.
2.3.1.2. Phương pháp thực hiện
- Trực tiếp điều tra chẩn đoán lâm sàng kết hợp mổ khám những lợn bệnh (là những lợn bắt đầu có triệu chứng lâm sàng của bệnh) và nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ lợn bệnh. Phương pháp điều tra là ngẫu nhiên trên các đàn lợn nuôi tại các hộ nông dân.
- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết. - Thông tin điều tra được ghi vào các phiếu điều tra.
- Trong điều tra dịch tễ học, chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu về dịch tễ học như: mô tả, phân tích và tổng hợp.
2.3.1.3. Nội dung điều tra, theo dõi
- Số lợn mắc bệnh phù đầu và chết do bệnh phù đầu ở lợn con tại các
hộ, các trang trại chăn nuôi.
- Các bệnh tích ở lợn mắc bệnh phù đầu khi tiến hành mổ khám, lấy
mẫu bệnh phẩm.
- Phương thức chăn nuôi và việc thực hiện vệ sinh chuồng trại.
2.3.1.4. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ, phương pháp phân tích dịch tễ
* Phƣơng pháp đo lƣờng trong dịch tễ.
Tổng số lợn mắc phù đầu
Tỷ lệ lợn mắc phù đầu (%) = x 100 Tổng số lợn điều tra
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tổng số lợn mắc phù đầu ở từng độ tuổi Tỷ lệ lợn mắc phù đầu (%) = x 100
theo độ tuổi Tổng số lợn điều tra
Tổng số lợn chết do mắc phù đầu Tỷ lệ lợn chết (%) = x 100 do mắc phù đầu Tổng số lợn mắc phù đầu Tổng số lợn khỏi bệnh Tỷ lệ lợn khỏi bệnh (%) = x 100 Tổng số lợn được điều trị * Phƣơng pháp phân tích dịch tễ.
Để so sánh nguy cơ mắc bệnh phù đầu và chết do bệnh phù đầu ở lợn con theo huyện, lứa tuổi, phương thức chăn nuôi, chúng tôi dùng chỉ tiêu nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR).
Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [26] nguy cơ tương đối, biểu thị bằng các cá thể có cảm nhiễm (có tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ nghi ngờ, được so sánh với nguy cơ phát triển bệnh đó, trong số các cá thể không cảm nhiễm (không tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ đó.
Để so sánh một yếu tố nguy cơ với các nhóm bệnh và nhóm đối chứng, số liệu dịch tễ học được thể hiện ở bảng sau:
Khai thác sau khi chọn Chủ động chọn vào nghiên cứu
Bệnh trạng
Cộng Có Không
Cảm nhiễm khi tiếp xúc với nguy cơ
Có a b a + b
Không c d c + d
Cộng a + c b + d a + b + c + d
Trong đó:
a: Số gia súc được chọn là có bệnh, có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ. b: Số gia súc không có bệnh, nhưng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
c: Số gia súc có bệnh nhưng không có tiếp xúc.
d: Số gia súc không có bệnh và cũng không có tiếp xúc. Nguy cơ tương đối được tính theo công thức sau:
Ie a/(a + b) RR = =
Io c/(c + d) Trong đó:
Ie là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm có cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ. Io là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm không cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ.
Đánh giá kết quả:
+ Nếu RR>1 sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ, trị số RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh.
+ RR = 1 bệnh và cảm nhiễm không liên quan gì đến nhau.
+ RR <1 kết hợp âm tính.
Dùng bình phƣơng (2) so sánh tần suất bệnh:
Bằng công thức của Nguyễn Văn Thiện và cs,(2002) [31].
(ad - bc)2 (a + b + c + d)
2
TN =
(a + b)(c + d)(a + c)(b + d) Các số liệu áp dụng trong nguy cơ tương đối.
Tìm giá trị 2 α ứng với độ tự do = (l1 - 1)(l2 - 1) = (2 - 1)(2 - 1) = 1. Ta tìm được các giá trị 2 α = 3,8; 6,6; 10,8 với mức = 0,05; 0,01; 0,001 bằng cách tra bảng. So sánh 2TN với 2
α để tìm xác suất xuất hiện giá trị 2
TN hoàn toàn do ngẫu nhiên sinh ra.
+ Nếu 2
TN > 2α tức P > 0,05 thì kết luận không có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ. + Nếu 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli
Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn theo quy trình thường quy sử dụng trong phòng thí nghiệm tại Bộ môn Vi trùng-Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục thú y.
Bệnh phẩm để phân lập vi khuẩn E. coli là: Hạch màng treo ruột, dịch ruột, chất chứa ruột non, máu, tim, gan, lách của những lợn chết, trước khi chết có triệu chứng lâm sàng của bệnh phù đầu. Bệnh phẩm sau khi lấy phải bao gói cẩn thận, ghi rõ tên chủ hộ, địa chỉ, tuổi lợn, ngày lấy mẫu và được tiến hành nuôi cấp phân lập ngay (chỉ để tối đa 4-5 giờ trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ lạnh) để tránh tạp khuẩn phát triển. Nếu không có điều kiện nuôi cấy, phân lập ngay thì để mẫu trong tủ lạnh, nhiệt độ 4-6o
C, bảo quản tối đa trong 24 giờ và theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ môn Vi trùng-Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục thú y và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
Cách xử lý bệnh phẩm: Cắt một mẫu bệnh phẩm phía trong (để tránh tạp khuẩn), dùng panh kẹp vô trùng ria trực tiếp lên thạch đĩa hoặc nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10, dùng ống hút lấy trên thạch máu, thạch thường, Macconkey. Bồi dưỡng ở 37o
C trong 24 giờ. Nếu lợn có triệu chứng đặc trưng, bệnh phẩm được cấy trực tiếp vào môi trường phân biệt như Macconkey. Trên các loại môi trường phân biệt để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn đường ruột. Mỗi loại vi khuẩn sẽ mọc những khuẩn lạc có kích thước, hình dáng, màu sắc khác nhau.
Sau khi phân lập các chủng vi khuẩn E. coli từ bệnh phẩm của lợn mắc bệnh phù đầu, chúng tôi đã giám định các đặc điểm về hình thái và nuôi cấy các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được. Bằng phương pháp làm tiêu bản, nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có hình thái, tính chất bắt màu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giống nhau. Vi khuẩn có dạng trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, bắt màu đỏ đều Gram (-), không nha bào và giáp mô.
Chúng tôi đã tiến hành giám định đặc điểm nuôi cấy trên các môi trường: Nước thịt, thạch thường, Macconkey, thạch máu, Endol, EMB, Kligler. Kết quả nuôi cấy cho thấy.
Trên môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2-3mm.
Trong môi trường nước thịt: Môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.
Trên môi trường Macconkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, gây dung huyết hoặc không gây dung huyết. Còn trên môi trường thạch Brilliant green thấy khuẩn lạc không màu trên nền vàng chanh, môi trường Simmon citrate có khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. Môi trường Endol: Khuẩn lạc màu đỏ. EMB: khuẩn lạc màu tím đen và môi trường SS: Khuẩn lạc có màu đỏ.
Chọn các khuẩn lạc đứng riêng rẽ, điển hình nuôi cấy vào môi trường thạch ống để tiến hành giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn phân lập.
Như vậy các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đều có đặc điểm hình thái, bắt màu, tính chất mọc giống như Bertschinger và cs, (1990) [35], đã mô tả phù hợp với Nguyễn Như Thanh và cs, (1974) [24]; (1997) [25]; Nguyễn Quang Tuyên, (2008) [30].
Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn E. coli thường quy của Bộ môn vi trùng - Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục thú y dựa trên quy trình phân lập giám định E. coli (Theo Carter G., 1995 [37]) được trình bày theo sơ đồ 2.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1: Chẩn đoán bệnh phù đầu do vi khuẩn E. coli
2.3.3. Phương pháp giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp thường quy khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp thường quy
Sau khi các giống vi khuẩn E. coli phân lập đã thuần khiết, tiến hành giám định một số đặc tính vi sinh vật hóa học cơ bản như đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy và các phản ứng lên men đường.
Đặc điểm dịch tễ Kiểm tra lâm sàng Mổ khám kiểm tra bệnh tích Phân lập, giám định sinh hoá Kết luận Bệnh phẩm Định týp huyết thanh Xác định yếu tố độc lực F18 và VT2e
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Kiểm tra hình thái học: Từ giống phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra nước thịt hoặc thạch nghiêng, làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra.
- Kiểm tra khả năng di động: Cấy chích sâu vi khuẩn vào thạch mềm hoặc xem di động của vi khuẩn trực tiếp trên kính hiển vi bằng tiêu bản giọt treo.
- Kiểm tra tính chất mọc bằng cách nuôi cấy trên các môi trường: Nước thịt, thạch thường, thạch máu, các môi trường đặc biệt như: MacConkey, Brilliant green agar. Quan sát tính chất mọc, hình thái, kích thước và màu sắc khuẩn lạc.
- Kiểm tra các đặc tính lên men đường của vi khuẩn E. coli.
+ Ống nghiệm thứ nhất: Trên môi trường thạch nghiêng KIA (Kligler Iron Agar): Dùng để đánh giá 4 chỉ tiêu: Lên men đường Lactoza, Glucoza, sinh hơi, sinh H2S. Cách đánh giá như sau:
Kỹ thuật cấy: Dùng que cấy vô trùng chấm vào khuẩn lạc định kiểm tra, ria một đường ở phần thạch nghiêng và cắm que cấy thẳng xuống phần thẳng đứng nhưng không chạm vào đáy ống, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Cách đọc kết quả (chậm nhất là 48 giờ): Môi trường KIA cho phép đọc các tính chất:
Khả năng lên men đường lactoza: Vi khuẩn có khả năng lên men đường lactoza làm cho phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng, ngược lại thì giữ nguyên màu.
Khả năng lên men đường glucoza: Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucoza thì chuyển phần thạch đứng từ màu hồng sang màu vàng rõ, vi khuẩn không lên men đường glucoza thì giữ nguyên màu.
Nếu sinh hơi thì phần thạch đứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên trong thạch đứng, có thể đẩy toàn bộ phần thạch lên cao, ở dưới là hơi.
Nếu đáy ống nghiệm có màu đen là do vi khuẩn có sản sinh H2S.
+ Ống nghiệm thứ 2 (trên môi trường Mannitol): Dùng que cấy chích sâu và cấy chích sâu một đường thẳng đứng vi khuẩn vào môi trường,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 370C/24 giờ. Dùng để đánh giá 2 chỉ tiêu: lên men đường Mannitol và di động. Cách đánh giá như sau:
Khả năng lên men đường mannitol: Vi khuẩn có khả năng lên men đường Mannitol thì làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng,
vi khuẩn không lên men đường thì màu môi trường giữ nguyên màu đỏ.
Khả năng di động: Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường, vi khuẩn không có khả năng di động thì sẽ mọc theo đường cấy chích sâu.
+ Ống nghiệm thứ 3 (Môi trường thạch ure): Dùng để đánh giá lên men Ure. Dùng que cấy thường ria cấy vi khuẩn cần kiểm tra trên bề mặt
