khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp thường quy
Sau khi các giống vi khuẩn E. coli phân lập đã thuần khiết, tiến hành giám định một số đặc tính vi sinh vật hóa học cơ bản như đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy và các phản ứng lên men đường.
Đặc điểm dịch tễ Kiểm tra lâm sàng Mổ khám kiểm tra bệnh tích Phân lập, giám định sinh hoá Kết luận Bệnh phẩm Định týp huyết thanh Xác định yếu tố độc lực F18 và VT2e
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Kiểm tra hình thái học: Từ giống phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra nước thịt hoặc thạch nghiêng, làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra.
- Kiểm tra khả năng di động: Cấy chích sâu vi khuẩn vào thạch mềm hoặc xem di động của vi khuẩn trực tiếp trên kính hiển vi bằng tiêu bản giọt treo.
- Kiểm tra tính chất mọc bằng cách nuôi cấy trên các môi trường: Nước thịt, thạch thường, thạch máu, các môi trường đặc biệt như: MacConkey, Brilliant green agar. Quan sát tính chất mọc, hình thái, kích thước và màu sắc khuẩn lạc.
- Kiểm tra các đặc tính lên men đường của vi khuẩn E. coli.
+ Ống nghiệm thứ nhất: Trên môi trường thạch nghiêng KIA (Kligler Iron Agar): Dùng để đánh giá 4 chỉ tiêu: Lên men đường Lactoza, Glucoza, sinh hơi, sinh H2S. Cách đánh giá như sau:
Kỹ thuật cấy: Dùng que cấy vô trùng chấm vào khuẩn lạc định kiểm tra, ria một đường ở phần thạch nghiêng và cắm que cấy thẳng xuống phần thẳng đứng nhưng không chạm vào đáy ống, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Cách đọc kết quả (chậm nhất là 48 giờ): Môi trường KIA cho phép đọc các tính chất:
Khả năng lên men đường lactoza: Vi khuẩn có khả năng lên men đường lactoza làm cho phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng, ngược lại thì giữ nguyên màu.
Khả năng lên men đường glucoza: Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucoza thì chuyển phần thạch đứng từ màu hồng sang màu vàng rõ, vi khuẩn không lên men đường glucoza thì giữ nguyên màu.
Nếu sinh hơi thì phần thạch đứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên trong thạch đứng, có thể đẩy toàn bộ phần thạch lên cao, ở dưới là hơi.
Nếu đáy ống nghiệm có màu đen là do vi khuẩn có sản sinh H2S.
+ Ống nghiệm thứ 2 (trên môi trường Mannitol): Dùng que cấy chích sâu và cấy chích sâu một đường thẳng đứng vi khuẩn vào môi trường,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 370C/24 giờ. Dùng để đánh giá 2 chỉ tiêu: lên men đường Mannitol và di động. Cách đánh giá như sau:
Khả năng lên men đường mannitol: Vi khuẩn có khả năng lên men đường Mannitol thì làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng,
vi khuẩn không lên men đường thì màu môi trường giữ nguyên màu đỏ.
Khả năng di động: Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường, vi khuẩn không có khả năng di động thì sẽ mọc theo đường cấy chích sâu.
+ Ống nghiệm thứ 3 (Môi trường thạch ure): Dùng để đánh giá lên men Ure. Dùng que cấy thường ria cấy vi khuẩn cần kiểm tra trên bề mặt thạch, bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 370C/24 giờ. Phản ứng dương tính thì môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu hồng, phản ứng âm tính môi trường không chuyển màu.
+ Ống nghiệm thứ 4 (Phản ứng sinh Indol): Dùng để đánh giá sản sinh Indol. Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth cấy vi khuẩn E. coli cần kiểm tra, bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 370C/24 giờ, nhỏ thuốc thử Kowacs vào. Phản ứng dương tính khi một vòng tròn đỏ xuất hiện ở trên cùng ống canh trùng. Phản ứng âm tính khi vòng tròn đỏ không xuất hiện.
Môi trường cimon citrat: Dùng que cấy thường ria cấy vi khuẩn cần kiểm tra trên bề mặt thạch, bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 370
C/24 giờ. Phản ứng dương tính thì môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh da trời, phản ứng âm tính môi trường không chuyển màu.
Môi trường VP-MR: Dùng que cấy vô trùng lây một vòng canh khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP-MR, bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 370
C/24 giờ, mang ra và thử các phản ứng.
VP: Nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch thuốc thử VP 1 và 2. Sau 5 phút, nếu môi trường có màu đỏ là dương tính, nếu không biến màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MR: Nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch thuốc thử MR. Sau 5 phút, nếu môi trường có màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính.