Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn theo quy trình thường quy sử dụng trong phòng thí nghiệm tại Bộ môn Vi trùng-Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục thú y.
Bệnh phẩm để phân lập vi khuẩn E. coli là: Hạch màng treo ruột, dịch ruột, chất chứa ruột non, máu, tim, gan, lách của những lợn chết, trước khi chết có triệu chứng lâm sàng của bệnh phù đầu. Bệnh phẩm sau khi lấy phải bao gói cẩn thận, ghi rõ tên chủ hộ, địa chỉ, tuổi lợn, ngày lấy mẫu và được tiến hành nuôi cấp phân lập ngay (chỉ để tối đa 4-5 giờ trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ lạnh) để tránh tạp khuẩn phát triển. Nếu không có điều kiện nuôi cấy, phân lập ngay thì để mẫu trong tủ lạnh, nhiệt độ 4-6o
C, bảo quản tối đa trong 24 giờ và theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ môn Vi trùng-Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục thú y và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
Cách xử lý bệnh phẩm: Cắt một mẫu bệnh phẩm phía trong (để tránh tạp khuẩn), dùng panh kẹp vô trùng ria trực tiếp lên thạch đĩa hoặc nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10, dùng ống hút lấy trên thạch máu, thạch thường, Macconkey. Bồi dưỡng ở 37o
C trong 24 giờ. Nếu lợn có triệu chứng đặc trưng, bệnh phẩm được cấy trực tiếp vào môi trường phân biệt như Macconkey. Trên các loại môi trường phân biệt để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn đường ruột. Mỗi loại vi khuẩn sẽ mọc những khuẩn lạc có kích thước, hình dáng, màu sắc khác nhau.
Sau khi phân lập các chủng vi khuẩn E. coli từ bệnh phẩm của lợn mắc bệnh phù đầu, chúng tôi đã giám định các đặc điểm về hình thái và nuôi cấy các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được. Bằng phương pháp làm tiêu bản, nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có hình thái, tính chất bắt màu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giống nhau. Vi khuẩn có dạng trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, bắt màu đỏ đều Gram (-), không nha bào và giáp mô.
Chúng tôi đã tiến hành giám định đặc điểm nuôi cấy trên các môi trường: Nước thịt, thạch thường, Macconkey, thạch máu, Endol, EMB, Kligler. Kết quả nuôi cấy cho thấy.
Trên môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2-3mm.
Trong môi trường nước thịt: Môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.
Trên môi trường Macconkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, gây dung huyết hoặc không gây dung huyết. Còn trên môi trường thạch Brilliant green thấy khuẩn lạc không màu trên nền vàng chanh, môi trường Simmon citrate có khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. Môi trường Endol: Khuẩn lạc màu đỏ. EMB: khuẩn lạc màu tím đen và môi trường SS: Khuẩn lạc có màu đỏ.
Chọn các khuẩn lạc đứng riêng rẽ, điển hình nuôi cấy vào môi trường thạch ống để tiến hành giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn phân lập.
Như vậy các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đều có đặc điểm hình thái, bắt màu, tính chất mọc giống như Bertschinger và cs, (1990) [35], đã mô tả phù hợp với Nguyễn Như Thanh và cs, (1974) [24]; (1997) [25]; Nguyễn Quang Tuyên, (2008) [30].
Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn E. coli thường quy của Bộ môn vi trùng - Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục thú y dựa trên quy trình phân lập giám định E. coli (Theo Carter G., 1995 [37]) được trình bày theo sơ đồ 2.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1: Chẩn đoán bệnh phù đầu do vi khuẩn E. coli