a. Phương pháp định tính.
Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng vi rút LMLM type cần chẩn đoán (type O) lên đĩa 96 giếng. Tỷ lệ 1/500.
12 µl kháng thể thỏ kháng FMDV type cần chẩn đoán + 60 ml buffer, cho vào mỗi giếng 50 µl, ủ ở 4°C qua đêm.
Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 10 10 11 11 12 12 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40
Ghi chú: C++: Huyết thanh đối chứng (+) mạnh
C+: Huyết thanh đối chứng (+) yếu
C-: Huyết thanh đối chưng (-)
Ca: Buffer A
Mỗi đĩa kiểm tra 40 mẫu Bước 2: Trung hòa
+ Pha loãng kháng thể đối chứng với tỷ lệ 1/16
15 µl C++ +225 µl buffer A
15 µl C+ +225 µl buffer A
15 µl C- +225 µl buffer A
+ Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1/16
10 µl huyết thanh + 150 µl buffer A, pha trong ống nhựa.
+ Ủ đĩa nhựa
Cột 1-2: Cho huyết thanh đối chứng (4 ô mỗi loại). 50 µl/giếng
Cột 3-12: Cho 50 µl huyết thanh kiểm tra đã pha loãng (2 ô/mẫu)
Cho 50 µl kháng nguyên đã biết vào tất cả các giếng, ủ ở nhiệt độ 4°C qua đêm. Bước 3: Gắn mầu vào đĩa phản ứng.
Hôm sau rửa đĩa đã gắn kháng thể 3 lần. Chuyển 50 µl/1 ô từ đĩa trung hòa sang đĩa phản ứng. Lắc, ủ ở 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1:100
Pha 55 µl kháng thể chuột lang kháng FMDV +5,5 ml buffer B. Cho 50
µl dung dịch này vào từng giếng phản ứng, lắc, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ,
rửa 3 lần.
Bước 5: Gắn Conjugate, tỷ lệ 1/200.
30 µl Conjugate + 6 ml buffer B, cho 50 µl vào mỗi giếng. Lắc, ủ ở nhiệt độ
37°C trong 40 phút, rửa 3 lần (giữ Conjugate thừa để kiểm tra mầu). Bước 6: Cho Substrate/ Chromogen, tỷ lệ 1/200.
30 µl H2O2 + 6 ml dung dịch ODP,
Cho 50 µl vào các giếng (giếng BLANK trước, giếng kiểm tra sau), ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp tối từ 15-30 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Cho 50 µl H2SO4 1,25M vào từng giếng (BLANK trước, giếng chứa mẫu sau). Đọc kết quả trên máy ELISA chương trình Program number 1 với bước sóng 492 nm.
Giá trị% (% PI) = 100 -
OD mẫu xét nghiệm
x 100 Trung bình OD của Ca
Nếu giá trị: PI < 50% là âm tính PI > 50% là dương tính
b. Phương pháp định lượng - Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 B C++ C++ 1 1 C C+ C+ 1 1 D C+ C+ 1 1 E C- C- 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 F C- C- 2 2 10 10 G Ca Ca 2 2 10 10 H Ca Ca 2 2 10 10
Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng FMDV lên đĩa nhựa.
Lấy 6 µl kháng thể thỏ kháng FMDV type O + 6 ml dung dịch gắn buffer Cho 50 µl/giếng vào 96 giếng của đĩa ELISA, ủ ở 4°C qua đêm
Bước 2: Trung hòa
Pha loãng kháng thể đối chứng, tỷ lệ 1/16
8 µl (C++, C+, C-) + 20µl buffer A (pha trong ống nhựa). Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1/8
10 µl huyết thanh + 70 µl bufferA (pha trong ống nhựa) Ủ đĩa nhựa:
C++: Huyết thanh đối chứng (+) mạnh C+ : Huyết thanh đối chứng (+) vừa C-: Huyết thanh đối chứng (-) Ca: Buffer A
Mỗi đĩa kiểm tra 10 mẫu.
Cột 1-2: Cho 30µl kháng thể đối chứng (C++, C+, C-) và Ca vào 4 giếng mỗi loại (Ca =bufferA).
Cột 3-12: Cho 30 µl buffer A/giếng vào 96 giếng.
Sau đó chuyển 30 µl huyết thanh kiểm tra vào hàng A và E rồi pha loãng theo cơ số 2 từ hàng A đến D, E đến H. Như vậy huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256.
Cho 30 µl kháng nguyên chuẩn O1 Manisa pha loãng 1/70 (pha với buffer A)
vào tất cả các giếng. Huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/16, 1/32,
1/64, 1/128, 1/256
Ủ đĩa qua đêm với nhiệt độ là 4°C Bước 3: Gắn mẫu vào đĩa phản ứng
Hôm sau rửa đĩa đã gắn kháng thể kháng FMDV 3 lần thấm khô. Chuyển 50
µl/giếng trung hòa sang đĩa phản ứng. Lắc, ủ ở 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần. Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1:100
Pha 52 µl kháng thể chuột lang kháng FMDV +5200 buffer B. Cho 50 µl dung
dịch này vào từng giếng phản ứng, lắc, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần. Bước 5: Gắn Conjugate, tỷ lệ 1/200.
30 µl Conjugate + 6 ml buffer B, cho 50 µl vào mỗi giếng. Lắc, ủ ở nhiệt độ
37°C trong 40 phút, rửa 3 lần (giữ Conjugate thừa để kiểm tra mầu). Bước 6: Cho Substrate/ Chromogen, tỷ lệ 1/200.
30 µl H2O2 + 6 ml dung dịch ODP
Cho 50 µl vào các giếng (giếng BLANK trước, giếng kiểm tra sau), ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp tối từ 15-30 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Cho 50 µl H2SO4 1,25M vào từng giếng (BLANK trước, giếng chứa mẫu sau). Đọc kết quả trên máy ELISA chương trình Program number 1 với bước sóng 492 nm.