* Máy móc
Máy móc trong phòng thí nghiệm bao gồm: Tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh thường, tủ sấy, buồng cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, nồi đun cách thủy, cân phân tích, tủ ấm 370
C, máy li tâm lạnh, máy lắc đĩa, máy lắc trộn (vortex mixer), máy lọc nước, máy đo pH, máy đọc ELISA với kính lọc 492 nm, máy PCR, máy rửa đĩa ELISA.
* Dụng cụ làm thí nghiệm
Các loại dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm bao gồm: Bình tam giác, ống đong thủy tinh, pipet thủy tinh, ống nghiệm các loại, hộp bảo quản và vận chuyển mẫu chuyên dụng, cân phân tích, micro pipet đơn kênh, micro pipep đa kênh, đầu típ nhựa các cỡ dùng cho micro pipet, bộ cối chày sứ, cát sạch để nghiền bệnh phẩm, khăn bông, dao, kéo, panh kẹp, đĩa nhựa polystyren 96 lỗ đáy chữ U, hóa chất, dung dịch cần thiết khác trong phòng thí nghiệm.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Điều tra một số chỉ tiêu liên quan đến chăn nuôi và dịch tễ bệnh LMLM trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh
Phương pháp điều tra dịch tễ học hồi cứu dựa vào số liệu của Cục Thống kê, phòng Chăn nuôi, Chi cục Thú y tỉnh Quảng Ninh.
2.4.2. Định type vi rút
Định type vi rút: Bằng huyết thanh và mẫu biểu mô của trâu bò nghi mắc bệnh LMLM.
2.4.3. Giám sát một số chỉ tiêu về huyết thanh học của đàn trâu bò trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh tỉnh Quảng Ninh
Đánh giá tỷ lệ nhiễm vi rút LMLM tự nhiên: Dựa trên kết quả xét nghiệm huyết thanh của trâu bò đã tiêm và chưa tiêm phòng vắc xin LMLM.
Đánh giá khả năng miễn dịch, độ dài miễn dịch sau tiêm phòng: Dựa trên kết quả xét nghiệm về định lượng kháng thể của huyết thanh trâu bò tại các thời điểm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày sau khi tiêm lần một.
2.4.4. Phương pháp lấy mẫu
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
- Trước tiên phải cố định gia súc (bằng giá hoặc chạc cây tùy từng điều kiện thích hợp), sau đó garo tĩnh mạch cổ sao cho tĩnh mạch cổ nổi rõ.
- Dùng bơm tiêm loại 10 ml hút 3 ml máu tự tĩnh mạch cổ, sau đó hút pittong ra đến 5 ml, bẻ gập đầu kim và đậy lắp kim lại, để nghiêng cho máu đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 2 giờ, sau đó chắt huyết thanh vào lọ thủy tinh hay lọ nhựa 2 ml vô trùng và gửi đến Phòng Thí nghiệm trong điều kiện lạnh (kèm các túi đá) càng sớm càng tốt.
- Bảo quản huyết thanh: Nếu huyết thanh được xét nghiệm ngay trong 7 ngày đầu tính từ lúc lấy mẫu thì bảo quản ở nhiệt độ 4ºC, còn nếu lâu hơn 7 ngày thì bảo quản ở nhiệt độ -30ºC.
* Phương pháp lấy mẫu biểu mô
- Kiểm tra lâm sàng và chọn gia súc mới phát bệnh, bệnh phẩm được lấy từ các tổn thương mới (không lấy mẫu từ các tổn thương ở giai đoạn lành sẹo hoặc đã được sát trùng và điều trị).
- Thu thập mẫu biểu mô ở những gia súc có triệu chứng của bệnh LMLM theo hướng dẫn của Cục Thú y và tuân thủ các quy tắc an toàn sinh học theo hướng dẫn của OIE để tiến hành xét nghiệm và định type vi rút.
- Loại mẫu là biểu mô lưỡi, lợi, kẽ móng chân, viền móng chân bị bong tróc do mụn nước mới vỡ ra, dịch trong mụn nước và da bao quanh mụn nước lúc chưa vỡ. - Mẫu bệnh phẩm được bảo quản 4 - 8°C trong hỗn hợp PBS 0,04 M và Glycerin (tỷ lệ 1:1), pH = 7,2 - 7,6 trong suốt quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Bảo quản mẫu bệnh phẩm ở 4°C nếu xét nghiệm trong 1-3 ngày hoặc -80°C nếu chưa xét nghiệm ngay.
2.4.5. Phương pháp xét nghiệm
2.4.5.1. Phương pháp ELISA FMD - 3ABC phát hiện kháng thể LMLM ở trâu bò do nhiễm tự nhiên nhiễm tự nhiên
* Nguyên tắc: Gia súc nhiễm bệnh LMLM sẽ sản sinh kháng thể kháng protein không cấu trúc (3ABC), trong khi gia súc khỏe mạnh, chưa bao giờ nhiễm bệnh được tiêm phòng vắc xin LMLM tinh khiết không có kháng thể này.
* Nguyên liệu: Bộ KIT chẩn đoán CHEKIT - FMD - 3ABC ELISA (mã FBT139T) do phòng thí nghiệm IDEXX Thụy Sỹ cung cấp và các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, các bước tiến hành được tóm tắt như sau:
- Đĩa ELISA được phủ kháng nguyên 3ABC của vi rút LMLM, kháng nguyên có độ tinh khiết cao được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp;
- Pha loãng huyết thanh với tỷ lệ 1: 100;
+ Mẫu huyết thanh trâu bò cần chẩn đoán, huyết thanh đối chứng dương, huyết thanh đối chứng âm chuẩn được pha loãng theo tỷ lệ 1/100 bằng dung dịch CHEKIT-FMD-3ABC-Sample-Diluent.
+ Cho 100 µl/giếng vào 96 giếng theo sơ đồ ở trang sau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Ủ ở 370C trong 60 phút. Phức hợp kháng nguyên 3ABC - kháng thể kháng 3ABC sẽ được tạo thành nếu trong huyết thanh có kháng thể kháng 3ABC. Rửa bằng dung dịch CHEKIT-Washing với lượng 300 µl/ giếng, rửa 3 lần để loại bỏ phần kháng thể 3ABC thừa.
- Gắn Conjugate, tỷ lệ 1: 200;
+ 55 µl CHEKIT-Anti - IgG-PO-Conjugate + 11 ml CHEKIT - Washing & Dilution - Solution.
+ Cho 100 µl/ giếng, ủ ở 370C trong 60 phút, sau đó rửa 3 lần thấm khô. - Cho cơ chất: Cho 100 µl CHEKIT- Chromogen, ủ ở nhiệt độ phòng 20-30 phút; - Dừng phản ứng: Cho 50 µl Stopping-Slution/giếng để nhiệt độ phòng; - Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm. - Đánh giá kết quả theo công thức:
Giá trị%(% OD) = ODsaple-ODneg x 100 ODpos- ODneg
Trong đó ODsample = của mẫu xét nghiệm. ODpos = đối chứng (+).
ODneg = đối chứng (-).
Mẫu dương tính khi OD > 30%, mẫu âm tính khi OD < 20%, mẫu nghi ngờ khi 20% < OD < 30%
- Sơ đồ thí nghiệm: + + + + + + + + + + + + A N N 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 B P P 8 8 ... ... ... ... ... ... ... ... C 1 1 ... ... D 2 2 ... ... E 3 3 ... ... F 4 4 ... ... G 5 5 45 45 H 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 46 46 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ghi chú: (+) : Kháng nguyên; N : Đối chứng âm; P : Đối chứng dương;
Số: 1, 2 ....46 : Mẫu huyết thanh xét nghiệm. 2.4.5.2. Phương pháp ELISA xác định type vi rút LMLM
* Nguyên lý: Kháng nguyên tương ứng sẽ được gắn với kháng thể đặc hiệu cho từng type vi rút đã được hấp phụ lên bề mặt các giếng của đĩa phản ứng, kháng thể tiếp theo sẽ gắn vào kháng nguyên. Mẫu kiểm tra có kháng nguyên tương ứng sẽ được gắn vào các lỗ của đĩa, mẫu kháng nguyên không tương ứng sẽ bị rửa trôi. Mẫu dương tính sẽ kết hợp với conjugate có gắn enzyme, phản ứng chuyển màu sẽ xảy ra khi có sự tham gia của chất xúc tác Substrate/Chromogen.
* Các bước tiến hành
- Xử lý bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm là biểu mô mụn nước được nghiền trong cối chày sứ với dung dịch BPS 0,04M theo tỷ lệ 1/5, sau đó cho huyễn dịch vào ống nghiệm và ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút thời gian 30 phút, loại bỏ cặn lấy nước trong. Lặp lại ly tâm 3 lần ta thu được dung dịch vi rút (kháng nguyên).
- Sơ đồ đĩa: Đĩa xét nghiệm gồm 96 lỗ được đánh số hàng ngang theo thứ tự từ 1-12 và hàng dọc từ A-H (08 hàng).
+ Theo hàng dọc, đĩa chia làm hai phần từ A-D và từ E-H tương ứng từng hàng với các serotype O, A, C, Asia-1, mỗi phần có thể xét nghiệm 3 bệnh phẩm.
+ Theo hàng ngang, từ cột 1-4 là các đối chứng kháng nguyên (+) mạnh và kháng nguyên (+) yếu. Cột 5 và 6 là cột BLANK (không tham gia phản ứng). Từ cột 7-12 là các mẫu bệnh phẩm (hai ô một bệnh phẩm). Trên một đĩa ELISA định type vi rút được 6 bệnh phẩm.
- Sơ đồ thí nghiệm: Serotype ĐC (+) mạnh ĐC (+) yếu BLANK Bệnh phẩm 1 Bệnh phẩm 2 Bệnh phẩm 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A O B A C C D Asia-1 E O F A G C H Asia-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Bệnh phẩm 4 Bệnh phẩm 5 Bệnh phẩm 6 Bước 1: Gắn đĩa (coating): Kháng thể thỏ kháng vi rút LMLM của các type O, A, C và Asia-1 được pha loãng tỷ lệ 1/500 với dung dịch gắn (dung dịch đệm).
Pha 1 lọ Bicarbonat Natri + 6,6 ml nước khoáng Lavie tinh khiết thành dung dịch buffer.
3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type O + 1,5 ml buffer. 3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type A + 1,5 ml buffer. 3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type C + 1,5 ml buffer. 3 µl kháng thể thỏ kháng FMD type Asia-1 + 1,5 ml buffer.
Cho 50 µl kháng thể thỏ kháng FMD các type trên vào các giếng tương ứng và ủ qua đêm ở 4°C hoặc lắc ủ ở 37°C trong khoảng thời gian 1 giờ. Tiếp theo rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS 0,01M.
Bước 2: Cho kháng nguyên ĐC (+) mạnh và kháng nguyên ĐC (+) yếu của từng type O, A, C, Asia-1 và huyễn dịch mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra vào các hàng tương ứng đã gắn kháng thể thỏ:
Cột 1-2: Cho 50 µl dung dịch kháng nguyên đối chứng (+) mạnh/giếng. Cột 3-4: Cho 50 µl dung dịch kháng nguyên đối chứng (+) yếu/giếng. Cột 5-6: Cho 50 µl buffer A/giếng.
Lắc ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần thấm khô.
Kháng nguyên đối chứng (+) mạnh và kháng nguyên đối chứng (+) yếu được pha loãng bằng dung dịch đệm A (buffer A) như sau:
Buffer A: 1 lọ PBS + 100 ml nước khoáng Lavie + 50 µl Twee 20 + 1 hoặc 2 giọt Red phenol, kiểm tra pH sao cho PBS 0.04M = 7,2 - 7,6.
Pha kháng nguyên trong ống nhựa.
Độ pha loãng kháng nguyên đối chứng (+) mạnh
các type O, A, C và Asia-1 KN (+) yếu =
1/KN mạnh 1/10 1/5 1/4 1/3 24 µl KN + 216 µl buffer A 48 µl KN + 192 µl buffer A 60 µl KN + 180 µl buffer A 80 µl KN + 160 µl buffer A 24 µl KN + 216 µl buffer A
Bước 3: Gắn kháng thể phát hiện (KT chuột lang): Mỗi giếng nhỏ 50 µl kháng thể chuột lang kháng vi rút LMLM type O, A, C và Asia-1 vào các giếng tương ứng. Mỗi type được pha loãng với dung dịch đệm B. Lắc đều, ủ nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần bằng dung dịch rửa PBS 0,01M rồi thấm khô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha dung dịch đệm B (Buffer B) = buffer A+0,6g bột sữa. KT type O: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B
KT type A: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B KT type C: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B KT type Asia-1: 15 µl KT + 1,5 ml Buffer B
Bước 4: Gắn Conjugate, tỷ lệ 1/200 mỗi giếng 50 µl 30 µl Conjugate + 6 ml buffer B
Lắc ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần thấm khô (giữ Conjugate thừa để kiểm tra màu).
Bước 5: Cho Subtrate/Chromogen tỷ lệ 1/200 30 µl H2O2 + 6 ml dung dịch ODP.
Mỗi giếng 50 µl, các giếng BLANK trước, giếng phản ứng sau, ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp tối từ 10-15 phút.
Bước 6: Dừng phản ứng, cho H2SO4 1,25M mỗi giếng 50 µl/lỗ tham gia phản ứng và cột BLANK.
Bước 7: Đọc kết quả trên máy ELISA, kính lọc 492 nm. Các mẫu kiểm tra có OD > 0,1 được coi là dương tính.
2.4.5.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể (Dùng cho một type)
a. Phương pháp định tính.
Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng vi rút LMLM type cần chẩn đoán (type O) lên đĩa 96 giếng. Tỷ lệ 1/500.
12 µl kháng thể thỏ kháng FMDV type cần chẩn đoán + 60 ml buffer, cho vào mỗi giếng 50 µl, ủ ở 4°C qua đêm.
Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 10 10 11 11 12 12 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40
Ghi chú: C++: Huyết thanh đối chứng (+) mạnh
C+: Huyết thanh đối chứng (+) yếu
C-: Huyết thanh đối chưng (-)
Ca: Buffer A
Mỗi đĩa kiểm tra 40 mẫu Bước 2: Trung hòa
+ Pha loãng kháng thể đối chứng với tỷ lệ 1/16
15 µl C++ +225 µl buffer A
15 µl C+ +225 µl buffer A
15 µl C- +225 µl buffer A
+ Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1/16
10 µl huyết thanh + 150 µl buffer A, pha trong ống nhựa.
+ Ủ đĩa nhựa
Cột 1-2: Cho huyết thanh đối chứng (4 ô mỗi loại). 50 µl/giếng
Cột 3-12: Cho 50 µl huyết thanh kiểm tra đã pha loãng (2 ô/mẫu)
Cho 50 µl kháng nguyên đã biết vào tất cả các giếng, ủ ở nhiệt độ 4°C qua đêm. Bước 3: Gắn mầu vào đĩa phản ứng.
Hôm sau rửa đĩa đã gắn kháng thể 3 lần. Chuyển 50 µl/1 ô từ đĩa trung hòa sang đĩa phản ứng. Lắc, ủ ở 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1:100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha 55 µl kháng thể chuột lang kháng FMDV +5,5 ml buffer B. Cho 50
µl dung dịch này vào từng giếng phản ứng, lắc, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ,
rửa 3 lần.
Bước 5: Gắn Conjugate, tỷ lệ 1/200.
30 µl Conjugate + 6 ml buffer B, cho 50 µl vào mỗi giếng. Lắc, ủ ở nhiệt độ
37°C trong 40 phút, rửa 3 lần (giữ Conjugate thừa để kiểm tra mầu). Bước 6: Cho Substrate/ Chromogen, tỷ lệ 1/200.
30 µl H2O2 + 6 ml dung dịch ODP,
Cho 50 µl vào các giếng (giếng BLANK trước, giếng kiểm tra sau), ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp tối từ 15-30 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Cho 50 µl H2SO4 1,25M vào từng giếng (BLANK trước, giếng chứa mẫu sau). Đọc kết quả trên máy ELISA chương trình Program number 1 với bước sóng 492 nm.
Giá trị% (% PI) = 100 -
OD mẫu xét nghiệm
x 100 Trung bình OD của Ca
Nếu giá trị: PI < 50% là âm tính PI > 50% là dương tính
b. Phương pháp định lượng - Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 B C++ C++ 1 1 C C+ C+ 1 1 D C+ C+ 1 1 E C- C- 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 F C- C- 2 2 10 10 G Ca Ca 2 2 10 10 H Ca Ca 2 2 10 10
Bước 1: Gắn kháng thể thỏ kháng FMDV lên đĩa nhựa.
Lấy 6 µl kháng thể thỏ kháng FMDV type O + 6 ml dung dịch gắn buffer Cho 50 µl/giếng vào 96 giếng của đĩa ELISA, ủ ở 4°C qua đêm
Bước 2: Trung hòa
Pha loãng kháng thể đối chứng, tỷ lệ 1/16
8 µl (C++, C+, C-) + 20µl buffer A (pha trong ống nhựa). Pha loãng huyết thanh kiểm tra, tỷ lệ 1/8
10 µl huyết thanh + 70 µl bufferA (pha trong ống nhựa) Ủ đĩa nhựa:
C++: Huyết thanh đối chứng (+) mạnh C+ : Huyết thanh đối chứng (+) vừa C-: Huyết thanh đối chứng (-) Ca: Buffer A
Mỗi đĩa kiểm tra 10 mẫu.
Cột 1-2: Cho 30µl kháng thể đối chứng (C++, C+, C-) và Ca vào 4 giếng mỗi loại (Ca =bufferA).
Cột 3-12: Cho 30 µl buffer A/giếng vào 96 giếng.
Sau đó chuyển 30 µl huyết thanh kiểm tra vào hàng A và E rồi pha loãng theo cơ số 2 từ hàng A đến D, E đến H. Như vậy huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256.
Cho 30 µl kháng nguyên chuẩn O1 Manisa pha loãng 1/70 (pha với buffer A)
vào tất cả các giếng. Huyết thanh kiểm tra lúc này có độ pha loãng là 1/16, 1/32,
1/64, 1/128, 1/256
Ủ đĩa qua đêm với nhiệt độ là 4°C Bước 3: Gắn mẫu vào đĩa phản ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hôm sau rửa đĩa đã gắn kháng thể kháng FMDV 3 lần thấm khô. Chuyển 50
µl/giếng trung hòa sang đĩa phản ứng. Lắc, ủ ở 37°C trong 1 giờ, rửa 3 lần. Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện, tỷ lệ 1:100
Pha 52 µl kháng thể chuột lang kháng FMDV +5200 buffer B. Cho 50 µl dung